HPLC測定補腎壯骨膏中補骨脂素的含量

賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

HPLC測定補腎壯骨膏中補骨脂素的含量

賴杰仁

（九江市中醫(yī)醫(yī)院，江西 九江 332000）

目的：建立補腎壯骨膏中補骨脂素的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜法，Pront osi l 120-5-C18色譜柱（250 m m×4.6 m m，5 μm），流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速1.0 m L/m i n；檢測波長246 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。結果：補骨脂素對照品進樣量在0.009 94～0.496 70 μg范圍內，進樣量與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 9），補骨脂素平均加樣回收率為98.20%，RSD為1.58%（n=6）。結論：本方法操作簡便，準確可靠，專屬性強，重現(xiàn)性好。適宜用于測定補腎壯骨膏中補骨脂素的含量。

補腎壯骨膏；補骨脂素；含量測定；高效液相色譜法

補腎壯骨膏系九江市中醫(yī)醫(yī)院自主研發(fā)的國家重點?？乒遣】铺厣t(yī)院制劑，本品由補骨脂、杜仲、川續(xù)斷、枸杞子、肉桂等十余味中藥組成，具有補腎壯骨、強筋益精、固本歸元的功效，臨床應用于肝腎兩虛、氣滯血瘀的老年性關節(jié)病，骨質疏松，腰腿痛，肢體麻木，耳鳴耳聾。十余年的臨床實踐表明，本品安全可靠，療效顯著?；谘a骨脂素在該復方制劑中作為主要的指標性成分，本文采用高效液相色譜法測定本品補骨脂素的含量，將補骨脂素的含量作為補腎壯骨膏的質量評價指標，旨在為本制劑建立內控標準。

1 儀器與藥品

高效液相色譜儀：W at ers系列高效液相色譜儀（W at ers 600 cont rol l er，PD A 2996型二極管陣列檢測器，Em pow er化學工作站）。SH IM A D ZU LC-2010A H T高效液相色譜儀，紫外可變波長檢測器，LC-sol ut i on色譜工作站。K Q 5200B型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

補骨脂素對照品（110739-201115，99.3%，原中國藥品生物制品檢定所），甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

補腎壯骨膏（批號：20120401，20120402，2012 0403，20120404，20120405，20120406，20120501，2012 0502，20120503，20120504，九江市中醫(yī)醫(yī)院研制）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Pront osi l 120-5-C18柱 （250 m m × 4.6 m m，5 μm）。流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）；流速：1.0 m L/m i n；檢測波長：246 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。理論板數(shù)按補骨脂素峰計算應不得低于3 000。

2.2 檢測波長的確定

用PD A檢測器對補骨脂素對照品與樣品溶液中與補骨脂素對照品相應位置上的色譜峰在400～ 210 nm波長范圍內進行光譜掃描，結果均在246 nm波長附近處有最大吸收，故確定檢測波長為246 nm。

2.3 樣品溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備精密稱取補骨脂素對照品10.01 m g，置 100 m L量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品母液。精密移取對照品母液10 m L，用甲醇定容至100 m L的容量瓶中，即得補骨脂素對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備裝量差異項下本品適量，取約 15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇100 m L，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kH z）45 m i n，取出，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液 25 m L，蒸干，殘渣加水30 m L使溶解，水溶液用乙酸乙酯提取4次，每次30 m L，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移到10 m L容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 陰性對照樣品溶液的制備除補骨脂以外，其余各藥材按補腎壯骨膏處方量制備陰性對照樣品，同“2.3.2”項下供試品溶液制備方法，制得缺補骨脂的陰性對照樣品溶液。

2.4 方法的專屬性試驗

分別精密吸取供試品溶液、陰性對照樣品溶液與對照品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件測定。結果顯示補骨脂素峰形良好，基線平穩(wěn)，對照品、供試品在相同時間有一色譜峰，而陰性對照樣品無干擾，見圖1。

2.5 線性關系考察

分別吸取“2.3.1”項下補骨脂素對照品溶液1，5，10，20 μL，對照品母液5 μL，注入液相色譜儀中，按“2.1”項下色譜條件測定補骨脂素峰面積，以進樣量（X）與峰面積（Y）線性回歸處理，在0.009 94～ 0.496 70 μg范圍內補骨脂素進樣量與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 9），回歸方程為：

圖1 補骨脂素HPLC圖

Y=7.570 96×106X－6.895 73×103（n=5），見圖2。

圖2 補骨脂素線性圖

2.6 精密度試驗

精密吸取 “2.3.1”項下補骨脂素對照品溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件，測定補骨脂素峰面積值，重復進樣測定6次，計算得對照品峰面積值相對標準差為0.89%，測定方法的精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

按“2.1”項下色譜條件，分別在 0，1，3，5，7，9，12，24小時，精密吸取照“2.3.2”項下制備的供試品（批號：20120401）溶液10 μL，測定供試品溶液中補骨脂素峰面積值，計算供試品補骨脂素峰面積值的相對標準差為1.27%，表明供試品溶液在24小時內基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

裝量差異項下本品（批號：20120401）適量，研細，取約15 g，共6份，精密稱定，照“2.3.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，處理結果數(shù)據(jù)，平均含量為19.01 μg/g，RSD為1.00%，方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗

裝量差異項下本品（批號：20120401，補骨脂素含量為19.01 μg/g）適量，研細，取6份，每份約7.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含補骨脂素（濃度1.457 μg/m L）對照品的70%甲醇混合溶液100.00 m L，稱定質量，照“2.3.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率（見表1）。樣品中補骨脂素平均回收率為98.20%，RSD值為1.58%（n=6），補骨脂素回收率良好。

2.10 耐用性試驗

裝量差異項下本品（批號：20120401，20120402）適量，研細，取約15 g，精密稱定，照“2.3.2”項下制備供試品溶液，分別用 A：Pront osi l 120-5-C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm），B：A gi l ent Ecl i pse X D B-C18（250 m m ×4.6 m m，5 μm），C：D i am onsi l C18（250 m m × 4.6 m m，5 μm）3種品牌的色譜柱，按“2.1”項下色譜條件測定補骨脂素含量，補骨脂素含量的RSD值低于1.00%（見表2）。

2.11 樣品測定

裝量差異項下本品10批次，研細，各取約15 g，精密稱定，照“2.3.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算補骨脂素含量（見表3），補骨脂素含量在17.52～ 20.37 μg/g，10批次本品補骨脂素平均含量為18.89 μg/g。根據(jù)表3測定結果，考慮藥材來源、配制操作等因素的差異影響，以平均含量的80%劃作補腎壯骨膏中補骨脂素含量的限度，即規(guī)定：本品每1 g含補骨脂以補骨脂素（C11H6O3）計，不得少于15 μg。

表1 補骨脂素回收率測定結果

表2 不同色譜柱測定補骨脂素含量結果

表3 補腎壯骨膏中補骨脂素含量（n=4）

3 討論

3.1 流動相的選擇

方法學研究試驗中，分別比較了以乙腈-水、甲醇-0.02 m ol/L磷酸氫二鉀溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相，考察補腎壯骨膏中補骨脂素的分離情況及峰形，結果以甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）為流動相的分離情況及峰形為佳；故確定流動相為：甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）。

3.2 供試品溶液制備的方法考察

在供試品溶液的制備方法試驗中，分別選擇了以70%甲醇加熱回流提取60分鐘，超聲處理（功率300 W，頻率25 kH z）提取45分鐘,考察提取方式對含量測定結果的影響，結果顯示這兩種提取方式差異不明顯，而超聲處理較簡便易行，故選用超聲處理提取方式制備供試品溶液。分別選擇了85%乙醇、70%甲醇、甲醇為提取溶劑，考察提取溶劑對含量測定結果的影響，結果以70%甲醇提取效果最好。分別用乙酸乙酯分別提取3，4，5次，考察不同提取次數(shù)對含量測定結果的影響，用乙酸乙酯提取4次即可得滿意結果。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1175-1176.

[2] 張蕊，馮曉川，徐延昭，等.H PLC測定癃閉舒片中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（21）：142-144.

[3] 張廣利.RP-H PLC法測定溫胃舒泡騰顆粒中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J].安徽醫(yī)藥，2010，14（11）：1288-1290.

Content Determination of Psoralen in Bushen Zhuanggu Plaster by HPLC

Lai Ji eren（Tradi t i onal Chi nese M edi ci ne H ospi t al of Ji uj i ang Ci t y，Ji angxi Ji uj i ang 332000，Chi na）

Objective:To est abl i sh a H PLC m et hod for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.Methods:H PLC w as carri ed out on Pront osi l 120-5-C18col um n （250 m m × 4.6 m m，5 μm）w i t h a m obi l e phase of m et hanol-0.2% phosphori c aci d （45∶55）,t he fl ow rat e w as 1.0 m L/m i n at U V det ect i on w avel engt h of 246 nm，t he col um n t em perat ure w as at 30℃，and t he sam pl e si ze w as 10 μL.Results:A good l i near rel at i onshi p of t he reference m at eri al of psoral en w as obt ai ned w i t hi n t he range of 0.009 94～ 0.496 70 μg，r=0.999 9.The average recovery of psoral en i s 98.20%，RSD=1.58% （n=6）.Conclusion:The m et hod i s conveni ent，accurat e and speci fi c w i t h a good reproduci bi l i t y,i t i s sui t abl e for t he cont ent det erm i nat i on of psoral en i n bushen zhuanggu pl ast er.

Bushen Zhuanggu Pl ast er；Psoral en；Cont ent D et erm i nat i on；H PLC

10.3969/j.i ssn.1672-5433.2015.04.005

2015-01-06）

賴杰仁，男，碩士，副主任藥師。研究方向：中藥新制劑與新技術。E-m ai l：sm z_l ai@163.com