綠色木霉JD-1固態(tài)發(fā)酵玉米芯產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化

武金霞，武 建，朱 曉，張賀迎*

（1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002）

纖維素酶是水解纖維素及其衍生物生成葡萄糖的一組酶的總稱，是由多種葡萄糖苷鍵水解酶組成的復(fù)雜酶系[1]。纖維素酶能夠?qū)⒅参锢w維原料水解，在食品、飼料、紡織、農(nóng)產(chǎn)品加工和資源再生等方面具有廣泛的用途和應(yīng)用前景。纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)目前主要有固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法，一般液態(tài)發(fā)酵纖維素酶活力較高，但生產(chǎn)成本高，廢液排放大。固態(tài)發(fā)酵法具有設(shè)備投資小、能耗低、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，采用固態(tài)發(fā)酵法利用廉價纖維素豐富的材料生產(chǎn)纖維素酶是降低生產(chǎn)成本的有效途徑[4-5]。林建國等[6-9]研究了固態(tài)發(fā)酵酒糟、稻草、秸稈、中藥殘?jiān)?、水葫蘆等生產(chǎn)纖維素酶，取得了一定結(jié)果。但固態(tài)發(fā)酵存在易染菌、傳質(zhì)不均勻、水活度低等缺陷，常導(dǎo)致酶活力較低。

目前認(rèn)為綠色木霉（Trichoderma viride）是產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的微生物菌株之一[10-12]。雖然近年利用植物纖維原料生產(chǎn)酒精方面的研究有了重大進(jìn)展，但仍然存在成本較高的問題。關(guān)鍵是纖維素酶活力低和酶產(chǎn)率低，從而造成纖維素酶生產(chǎn)成本高。因此，提高纖維素酶活力和酶產(chǎn)率，降低纖維素酶制備成本是實(shí)現(xiàn)植物纖維資源轉(zhuǎn)化的工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。玉米是我國的主要糧食作物，其副產(chǎn)物產(chǎn)量高達(dá)幾十億噸，但其利用率一直很低。本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的綠色木霉菌株發(fā)酵玉米芯，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件進(jìn)行優(yōu)化，為降低纖維素酶生產(chǎn)成本及玉米芯廢棄物的有效利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

綠色木霉（Trichoderma viride）JD-1：河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自來水1 000 mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基（500 mL三角瓶）：玉米芯（過40目篩）14 g，麩皮（過40目篩）6 g，Mandels無機(jī)鹽營養(yǎng)液40 mL，自然pH，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；CMC-Na（分析純）：成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；濾紙：杭州特種紙業(yè)有限公司；磷酸氫二銨（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HS-800D恒溫水槽：太倉市利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；YMJ-S250F霉菌培養(yǎng)箱：上海姚氏儀器設(shè)備廠；722型可見分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 孢子懸液的制備

將培養(yǎng)4d的PDA平板，用滅過菌的蒸餾水洗下孢子，用移液槍轉(zhuǎn)移到含玻璃珠和無菌水的滅菌三角瓶中充分振蕩。在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度至107個/mL，作為種子液，備用。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵

將制備好的孢子菌懸液接種到已經(jīng)配好的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，接種量為10%，28℃條件下下恒溫恒濕（相對濕度95%）發(fā)酵培養(yǎng)4 d，在36 h搖動三角瓶，防止培養(yǎng)基板結(jié)影響通氣。

1.3.3 粗酶液的制備

取固態(tài)發(fā)酵物1 g，加入生理鹽水10 mL（1∶10），在搖床上30℃、180 r/min水浴浸提l h，然后在5 000 r/min的冷凍離心機(jī)上離心15 min，提取上清液用生理鹽水定容至10 mL，即為粗酶液。放置10 min，待測。

1.3.4 纖維素酶活力測定[13]

羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）活力測定：采用3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）法。酶活力單位定義為：在50℃、pH4.8、恒溫作用30min的條件下，以水解反應(yīng)中每分鐘由底物羧甲基纖維素鈉（carboxy methylated cellulose-Na，CMC-Na）生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位（IU/g）。

濾紙酶（filter paper lyase，F(xiàn)PAase）活力測定酶活力單位定義為：在50℃、pH 4.8、恒溫作用60 min的條件下，以水解反應(yīng)中每分鐘由底物（杭州一號定性濾紙）生成1μmoL葡萄糖所需的酶量為1個酶活力單位（IU/g）。濾紙酶活力計(jì)算公式如下：

式中：5.56為1mg葡萄糖的微摩爾數(shù)（1000/180=5.56），μmoL；樣品質(zhì)量為發(fā)酵后的測定固體質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)確定菌株固態(tài)發(fā)酵工藝

分別選取玉米芯與麩皮質(zhì)量比（10∶0、9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9、0∶10（g∶g））、氮源種類（豆粕、尿素、氯化銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、硝酸鉀）、氮源含量（0、1%、2%、3%、4%）、發(fā)酵溫度（25 ℃、28℃、31℃、34℃）、發(fā)酵時間（48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h、120 h）、料水比（1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0（g∶mL））及接種量（5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%）等影響因素來考察其對纖維素酶活力的影響。每個試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝

結(jié)合單因素結(jié)果，以纖維素酶活力為評價指標(biāo)，選取選擇玉米芯∶麩皮（A）、料水比（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，從而優(yōu)選最佳固態(tài)發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for solid-state fermentation process optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 固體發(fā)酵單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同原料比例對纖維素酶活力的影響

圖1 玉米芯和麩皮質(zhì)量比對纖維素酶的影響Fig.1 Effect of wheat bran and corn cob ratio on cellulase activity

發(fā)酵培養(yǎng)基的配制中改變原料配比，玉米芯和麩皮質(zhì)量比分別為10∶0、9∶1、7∶3、5∶5、3∶7、1∶9、0∶10（g∶g），其他發(fā)酵條件相同，不同玉米芯和麩皮質(zhì)量比對纖維素酶活力的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著玉米芯和麩皮質(zhì)量比增大，羧甲基纖維素酶及濾紙酶活力逐漸提高。結(jié)果表明，玉米芯∶麩皮=7∶3（g∶g）時纖維素酶活力最高，CMC酶活達(dá)5.78 IU/g，濾紙酶活力0.81 IU/g。因此，玉米芯∶麩皮7∶3（g∶g）為宜。

2.1.2 不同氮源對纖維素酶活力的影響

在發(fā)酵物料中添加不同種類的氮源（豆粕、尿素、氯化銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、硝酸鉀），添加量均為1%，其他發(fā)酵條件相同，不同氮源對纖維素酶活力的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對纖維素酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on cellulase activity

由圖2可知，不同氮源對產(chǎn)纖維素酶有不同程度的影響。結(jié)果表明，銨態(tài)氮比其它態(tài)氮更有利于該菌株。添加1%硫酸銨時纖維素酶活最高CMC酶活達(dá)6.62 IU/g，濾紙酶活力0.79IU/g。為最佳氮源，磷酸氫二銨、氯化銨、豆粕其次。因此，氮源選擇硫酸銨為宜。

2.1.3 硫酸銨添加量對纖維素酶活力的影響

在發(fā)酵物料中分別添加0、1%、2%、3%、4%硫酸銨，其他發(fā)酵條件相同，不同硫酸銨添加量對纖維素酶活力的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同硫酸銨添加量對纖維素酶的影響Fig.3 Effect of ammonium sulphate addition on cellulase activity

由圖3可知，隨著硫酸銨添加量增加，羧甲基纖維素酶及濾紙酶活力增加。結(jié)果表明，硫酸銨添加量為2%時，纖維素酶活最高，CMC酶活為7.43IU/g，濾紙酶活力1.66IU/g。因此，最佳硫酸銨添加量為2%。

2.1.4 不同料水比對纖維素酶活力的影響

培養(yǎng)基中水分含量是微生物體內(nèi)外的溶媒，對微生物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、代謝產(chǎn)物（酶）的合成和分泌有著重要作用[14]。考察不同料水比1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0（g∶mL）對產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖4。

圖4 不同料水比對纖維素酶的影響Fig.4 Effect of different solid to liquid ratio on cellulase activity

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著料水比的增加，纖維素酶活增加，料水比為1∶2（g∶mL）時，纖維素酶活最高，CMC酶活達(dá)8.36 IU/g，濾紙酶活力1.78 IU/g。之后料水比再增加，纖維素酶活降低，發(fā)酵表現(xiàn)為前期生長緩慢，后期漸漸生長，發(fā)酵周期有所延長。因此，料水比1∶2（g∶mL）為宜。

2.1.5 接種量對纖維素酶活力的影響

接種量分別為5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%，其他發(fā)酵條件相同，考察不同接種量對纖維素酶活力的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同接種量對纖維素酶活力的影響Fig.5 Effect of different inoculum on cellulase activity

由圖5可知，隨著接種量增加，酶活增加，在10%時纖維素酶活達(dá)到最大，CMC酶活8.41 IU/g，濾紙酶活力1.85 IU/g。之后再加大接種量，纖維素酶活降低，原因可能是菌絲生長旺盛，會形成抑制，另外菌體大量生長產(chǎn)熱多，使培養(yǎng)基內(nèi)部溫度升高，從而影響了產(chǎn)酶[15]。因此，接種量10%為宜。

2.1.6 發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響

在發(fā)酵溫度分別為25℃、28℃、31℃、34℃，其他發(fā)酵條件相同時，考察不同發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵溫度對纖維素酶活力的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on cellulase activity

由圖6可知，在28℃、31℃時纖維素酶處在較高水平，溫度再高纖維素酶活受到抑制。結(jié)果表明，在28℃培養(yǎng)時，纖維素酶活力達(dá)到最高，CMC酶活8.43 IU/g，濾紙酶活力1.89 IU/g。因此，發(fā)酵溫度28℃為宜。

2.1.7 發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響

從發(fā)酵48h起每隔12h測定纖維素酶酶活力，其他發(fā)酵條件相同，考察不同發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響Fig.7 Effect of fermentation time on cellulase activity

由圖7可知，在培養(yǎng)過程中，CMC酶活和濾紙酶活均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在培養(yǎng)96 h時，均達(dá)到產(chǎn)酶高峰，CMC酶活8.53 IU/g，濾紙酶活力1.9 IU/g。發(fā)酵時間＞96 h，酶活力快速下降。因此，發(fā)酵時間96 h為宜。

2.2 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定硫酸銨添加量為2%，接種量為10%，以羧甲基纖維素酶活力為評價指標(biāo)，選取選擇玉米芯∶麩皮（A）、料水比（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）為4個因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for solid state fermentation process optimization

由表2可知，極差的大小順序?yàn)锳＞B＞D＞C，即玉米芯：麩皮＞料水比＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度，說明在綠色木霉固態(tài)發(fā)酵過程中，對產(chǎn)酶影響最大的因素是原料配比，料水比、發(fā)酵時間次之，溫度的影響最小。綠色木霉固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵的最優(yōu)條件為A2B2C3D2，即玉米芯∶麩皮=7∶3（g∶g），發(fā)酵溫度30 ℃，料水比=1∶2.0（g∶mL），固態(tài)發(fā)酵時間96 h。在此最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3組平行實(shí)驗(yàn)的CMCase平均酶活為8.95 IU/g；FPAase平均酶活為2.00 IU/g。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，料水比對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其余因素對結(jié)果影響均不顯著。

3 結(jié)論

微生物的生長和代謝產(chǎn)物的積累受培養(yǎng)基組成如碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等多種因素的影響，上述因素對不同菌株的影響也各不相同。本研究發(fā)現(xiàn)，綠色木霉JD-1固態(tài)發(fā)酵玉米芯產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件是玉米芯與麩皮質(zhì)量比7∶3（g∶g），發(fā)酵溫度30 ℃，料水比1∶2.0（g∶mL），發(fā)酵時間96 h，接種量為10%，硫酸銨添加量為2%。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，CMCase酶活力為8.95 IU/g，F(xiàn)PAase酶活達(dá)2.00 IU/g，酶活力高于已有的一些報道。

天然農(nóng)作物秸稈和玉米芯等生物質(zhì)具有高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和成分組成，在其降解過程中需要多種酶的共同作用，木質(zhì)素的崩解有利于纖維素成分的降解，而纖維素的完全降解需要內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶、外切β-1,4-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖苷酶的協(xié)同作用。

在后續(xù)深入研究中，應(yīng)對菌株進(jìn)行改造，以期得到高產(chǎn)纖維素酶和纖維素酶組分比例協(xié)調(diào)的菌株，提高產(chǎn)酶量，降低生產(chǎn)成本；另一方面需要篩選具有不同產(chǎn)酶特性的菌株，采用多菌株的混合發(fā)酵，以豐富發(fā)酵物的酶系，提高秸稈資源的綜合利用效率。

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