人工栽培獼猴桃釀酒酵母篩選研究

王 燕，劉 娟

（樂山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614004）

獼猴桃被譽(yù)為維生素C之王，鮮果及其深加工產(chǎn)品都深受國內(nèi)外消費(fèi)者青睞[1]。隨著人工獼猴桃栽培技術(shù)的成熟與發(fā)展，栽培獼猴桃產(chǎn)量劇增，但獼猴桃不耐貯藏，尤其在生產(chǎn)旺季，給產(chǎn)地獼猴桃銷售造成困境，加大果實(shí)加工產(chǎn)品的開發(fā)，對于獼猴桃資源的利用有很大的意義和前景[2-5]。

如今獼猴桃酒的生產(chǎn)工藝大多是自然發(fā)酵或采用葡萄酒酵母、釀酒活性干酵母作為釀酒菌株，但自然發(fā)酵生產(chǎn)過程不易控制，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)范化及大規(guī)模生產(chǎn)；而采用葡萄酒酵母、釀酒活性干酵母作為釀酒菌株，由于這些菌種并不是針對獼猴桃酒的生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)開發(fā)出來的，釀酒產(chǎn)品效果并不好[6-7]。本研究從峨眉山地區(qū)生產(chǎn)的成熟野生獼猴桃中分離篩選出優(yōu)良的獼猴桃釀酒酵母菌株MY-20[6]，然后以人工栽培獼猴桃為原料，分別以篩選菌株和MY-20為發(fā)酵菌株進(jìn)行果酒發(fā)酵對比。期望篩選出產(chǎn)酸、產(chǎn)酒、口感及其他一些發(fā)酵特征均較優(yōu)的、適合人工栽培獼猴桃為原料的釀酒酵母菌株。使之經(jīng)后期馴化能成為適合獼猴桃工業(yè)釀酒的專用菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵原料

人工栽培獼猴桃：樂山地區(qū)市售。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌種

釀酒酵母菌株MY-20：樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院資源微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基[3，6]

酵母菌種培養(yǎng)及篩選培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉。

酵母菌發(fā)酵液體培養(yǎng)基：含40%獼猴桃果汁，蔗糖2%。

1.2 儀器設(shè)備

CX41生物顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社；WS-300恒溫?fù)u床：德國WIGGENS公司；GHP-9080恒溫培養(yǎng)箱、SW-CJ-2FD超凈工作臺：揚(yáng)州慧科電子有限公司；YH110酒精計(jì)：青縣燕河儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃果汁液體培養(yǎng)基制備

先將獼猴桃進(jìn)行分選，去雜物和霉?fàn)€果，再用流動水沖洗，去皮，在冰柜中預(yù)冷至10℃，迅速打漿，將勻漿轉(zhuǎn)入大燒杯中，加入果膠酶100 mg/L，密封燒杯口，室溫條件下酶解12 h。酶解結(jié)束后的漿液用4層紗布過濾，濾液置于燒杯中4℃靜置冷卻0.5 h。取上清液作為發(fā)酵培養(yǎng)基。將上述獼猴桃汁上清液分裝入已滅菌的發(fā)酵瓶，每瓶150 mL，然后加3 g蔗糖搖勻[8]，紫外燈照射1 h滅菌。

1.3.2 人工栽培獼猴桃酵母菌種的分離純化[3，6]

將成熟軟化的栽培獼猴桃切一小塊果皮放入獼猴桃果汁液體培養(yǎng)基中，室溫條件下（25～28℃）培養(yǎng)。每隔12 h觀察一次，選取感官判斷帶有明顯酒味的發(fā)酵試管，搖勻管內(nèi)液體后梯度稀釋（10-1，10-2，……），然后把原發(fā)酵液與稀釋液分別涂布于無菌酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）平板，每個濃度各涂布10個平板，標(biāo)記，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察菌落。挑選長勢較好，形態(tài)不相同，與MY-20也明顯不同的酵母菌落分別接種至無菌YEPD斜面，28℃恒溫培養(yǎng)。然后同樣條件平板培養(yǎng)，觀察記錄菌落菌苔形態(tài)，鏡檢確定并記錄細(xì)胞形態(tài)[2]。

1.3.3 不同酵母發(fā)酵對比

將從獼猴桃中篩選出的菌株與MY-20同時進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。每種菌株分別接種3環(huán)到無菌獼猴桃果汁液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床60 r/min，28℃培養(yǎng)。再分別測其產(chǎn)酒、產(chǎn)酸性能，并對其發(fā)酵液感官特性作出評價(jià)。

1.3.4 分析檢測

酵母菌株產(chǎn)酒力測定、發(fā)酵液的酸度測定[9]：按國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法；發(fā)酵液感官特性評價(jià)：感官評價(jià)[10-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培獼猴桃酵母菌種的分離純化結(jié)果

據(jù)菌落的生長特征及顯微鏡下酵母細(xì)胞的觀察，篩選出3株產(chǎn)酒酵母菌，分別編號為ZMJ-1、ZMJ-2、ZMJ-1。各菌株生長及細(xì)胞形態(tài)記錄見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室篩選菌株特征Table 1 Features of selected strains

2.2 菌株發(fā)酵過程中酸度變化測定結(jié)果

酸度是評判獼猴桃酒酵母菌發(fā)酵效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)。酸度過高會使獼猴桃酒口感不愉悅，酸度過低則使口味趨于平淡。所以，好的菌株應(yīng)該是在發(fā)酵過程中使發(fā)酵液既具備一定的酸度，保證好的口感，又能在發(fā)酵過程中使發(fā)酵液的pH值不繼續(xù)降低[2]。

從剛剛接入菌種開始計(jì)時，測定發(fā)酵初（第0天）的發(fā)酵液pH，之后每間隔1 d測定一次。測得發(fā)酵液的pH值如圖1所示。

圖1 發(fā)酵時間對發(fā)酵液pH值的影響Fig.1 Effect of fermentation time on fermentation broth pH

由圖1可見，接種ZMJ-3的發(fā)酵液于第1天pH值出現(xiàn)下降，且之后一直維持低pH狀態(tài)。規(guī)?；a(chǎn)中為保證生產(chǎn)效率，發(fā)酵果汁一旦濃縮，會造成發(fā)酵液酸性過強(qiáng)，會對生產(chǎn)過程在很大程度上造成不利影響。接種ZMJ-1培養(yǎng)基在發(fā)酵前2dpH呈下降趨勢，第3天開始上升，并趨于平穩(wěn)，最終pH維持在3.67左右；接種MY20菌株的培養(yǎng)基pH值同樣在前2 d下降，在第3天開始上升，但上升速度較ZMJ-1慢，且最終pH也相對略低；接種ZMJ-2的發(fā)酵液在前3 d pH下降，最低pH達(dá)3.62，與ZMJ-3相同，雖于第4天pH出現(xiàn)上升，但pH值明顯低于ZMJ-1和MY-20。綜上所述，從發(fā)酵液的pH值變化方面考慮，ZMJ-1和MY-20較優(yōu)。第2天接種ZMJ-1的發(fā)酵液pH值為3.64，MY-20的發(fā)酵液為pH 3.65，雖然前者略低，但差距并不明顯。第3天ZMJ-1的發(fā)酵液pH值為3.66，上升明顯，而MY-20發(fā)酵液為pH 3.65，明顯低于ZMJ-1。因此，從發(fā)酵pH值的變化角度考慮，ZMJ-1更快達(dá)到高值并趨于穩(wěn)定，較為適宜。

2.3 菌株產(chǎn)酒精能力測定結(jié)果[2]

優(yōu)良的釀酒菌株應(yīng)該是產(chǎn)酒力達(dá)到某個所需酒精度（一般果酒酒精度在7%vol左右）的時間越短越好。按照酒精計(jì)法，分別于發(fā)酵第3天與發(fā)酵第5天測定發(fā)酵液酒精度，酒精度測量結(jié)果見表2。

從表2可見，ZMJ-1產(chǎn)酒能力最優(yōu)，5 d后酒精度達(dá)到7.3%vol。MY-20于5 d后發(fā)酵液酒精度為6.8%vol，低于ZMJ-1，且與之前以野生獼猴桃為發(fā)酵液時（5 d后MY-20發(fā)酵液酒精度達(dá)7.8%vol）比較，相對較低[2]。這可能與栽培獼猴桃原料糖含量較野生獼猴桃低以及ZMJ-1來源于栽培獼猴桃內(nèi)生菌株篩選分離，更能適應(yīng)原料、生長較好有關(guān)。由此可見，若以栽培獼猴桃為釀酒原料，ZMJ-1在產(chǎn)酒力方面更有優(yōu)勢。

表2 各菌株發(fā)酵結(jié)果Table 2 The fermentation results of strains

2.4 發(fā)酵過程中獼猴桃酒的感官評價(jià)[2]

表3 發(fā)酵第3天及第5天發(fā)酵液感官評價(jià)Table 3 Sensory evaluation of fermentation broth after fermentation for 3 d and 5 d

由表3可知，4株菌株在發(fā)酵過程中均出現(xiàn)了不同程度的泡沫。ZMJ-1在發(fā)酵第3天出現(xiàn)少量泡沫，發(fā)酵第5天泡沫量減少，表面只有極少量泡沫。其次是MY-20，發(fā)酵第3天出現(xiàn)少量泡沫，發(fā)酵第5天表面泡沫量較其第3天少，比ZMJ-1多。ZMJ-2雖然在第5天表面泡沫量與MY-20相當(dāng)，但是第3天出現(xiàn)了較多泡沫，這在工業(yè)上是不利因素。ZMJ-3第3天出現(xiàn)少量泡沫，第5天泡沫量大。因此，在產(chǎn)生泡沫量方面，ZMJ-1表現(xiàn)最優(yōu)。從發(fā)酵液感官特性來看，ZMJ-2和ZMJ-3二者較差，在第5天均出現(xiàn)了不同程度的敗酸味。第5天二者發(fā)酵液均具有澄清、有光澤的優(yōu)良品質(zhì)，且具有一定的果味和酒味適宜。因此，從感官評價(jià)考慮，ZMJ-1較為適宜。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從栽培獼猴桃原料本身分離篩選出了3株釀酒酵母ZMJ-1、ZMJ-2、ZMJ-3。3株酵母均具有一定的產(chǎn)酒能力。

從與實(shí)驗(yàn)室已有從野生獼猴桃原料中分離的優(yōu)良菌株MY-20一同進(jìn)行了栽培獼猴桃為原料的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：

ZMJ-1和MY-20在發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值變化均為先小幅下降，然后上升至pH 3.67左右，超過原液pH值。但ZMJ-1發(fā)酵液pH值上升更迅速，更快趨于穩(wěn)定，所以從發(fā)酵pH值的變化角度考慮，ZMJ-1優(yōu)于MY-20。

發(fā)酵5 d后ZMJ-1發(fā)酵液酒精度達(dá)到7.3%vol。MY-20達(dá)到6.8%vol，皆接近果酒適宜酒精度。但MY-20產(chǎn)酒能力低于ZMY-1，也低于之前以野生獼猴桃為發(fā)酵原料產(chǎn)酒（5 d后MY-20發(fā)酵液酒精度達(dá)7.8%vol）[2]。這可能與栽培獼猴桃原料糖含量較野生獼猴桃低，以及MY-20較ZMJ-1不能更好的適應(yīng)原料，生長受到不良影響有關(guān)。由此可見若以栽培獼猴桃為釀酒原料，ZMJ-1更優(yōu)。

ZMJ-1和MY-20發(fā)酵液在感官性狀方面表現(xiàn)優(yōu)良，第5天二者發(fā)酵液均具有澄清、有光澤的優(yōu)良品質(zhì)，且具有一定的果味和酒味適宜。從感官品質(zhì)考慮，ZMJ-1略優(yōu)于MY-20。

綜上，若以栽培獼猴桃為原料規(guī)?；勗飓J猴桃酒，ZMJ-1和MY-20均為較優(yōu)良釀酒菌株，但ZMJ-1在發(fā)酵性能上優(yōu)于MY-20，因此，ZMJ-1經(jīng)過后期馴化改良，有望成為工業(yè)化生產(chǎn)獼猴桃酒的釀酒菌株。

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