膜技術(shù)在L-丙氨酸提純工藝中的應(yīng)用研究

王貝貝，曹恒霞*，張建嵩，彭文博

（江蘇久吾高科技股份有限公司，江蘇 南京 211808）

L-丙氨酸雖是人體非必需氨基酸，但卻是人體血液中含量最高的氨基酸[1]。它可為轉(zhuǎn)氨酶提供氨基供體，在臨床上常添加到輸液中；在食品工業(yè)中，L-丙氨酸可作為甜味劑和鮮味劑，正越來越受到人們的歡迎和重視；在醫(yī)藥行業(yè)，L-丙氨酸是生產(chǎn)維生素B6及L-氨基丙醇的主要原料[2]；另外，在高分子材料方面，近年來發(fā)現(xiàn)聚乳酸中添加L-丙氨酸可有效提高聚乳酸的性能[3]。

目前，L-丙氨酸的主要工業(yè)生產(chǎn)方法是游離細(xì)胞酶法，即以L-天冬氨酸為原料，通過β-脫羧酶脫去β位的羧基而得到[4-5]。但有關(guān)L-丙氨酸的提取工藝的文獻(xiàn)報(bào)道不多，蔣光玉[6]運(yùn)用超濾、樹脂、活性炭吸附等工藝從發(fā)酵液中提取L-丙氨酸，生產(chǎn)的L-丙氨酸符合中國(guó)藥典（2010）標(biāo)準(zhǔn)。

由于發(fā)酵液中含有大量的菌體、蛋白和大分子有機(jī)物，傳統(tǒng)的分離濃縮過濾方法主要有真空轉(zhuǎn)鼓過濾、板框壓濾等，但這些方法只能將發(fā)酵液中的菌絲體、固體雜質(zhì)等固形物去除，而無法將可溶性的蛋白、有機(jī)物等分離；此外，由于發(fā)酵液中含有許多色素，這些色素的存在影響了L-丙氨酸的分析，造成分析誤差，并會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物純度下降，所以在提純過程中必須去除。因活性炭對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，易于操作，所以傳統(tǒng)方法采用活性炭[7]去除發(fā)酵液中的色素，但活性炭吸附能力有限，且不易再生，目前采用的方法主要有納濾[8]、吸附樹脂法[9-10]等。

膜分離技術(shù)目前以其特有的分離優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)不同粒徑混合物的分離，并在發(fā)酵液提取分離領(lǐng)域有著廣泛地應(yīng)用[11-15]。因此，若將不同的膜分離過程結(jié)合使用，可代替上述方法，或可部分取代而節(jié)約成本。本實(shí)驗(yàn)以L-丙氨酸發(fā)酵液為過濾對(duì)象，采用陶瓷膜、納濾膜及相應(yīng)設(shè)備分別進(jìn)行澄清過濾、脫鹽脫色，為生產(chǎn)高純度的L-丙氨酸創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-丙氨酸發(fā)酵液：秦皇島華恒生物工程有限公司；丙醛（純度98%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

0.24 m2陶瓷膜設(shè)備：江蘇久吾高科技股份有限公司；XN45納濾膜、UA60納濾膜、DK納濾膜：美國(guó)Trisep公司；UV-757紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；TG16-WS臺(tái)式離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；離子色譜ICS2100：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丙氨酸純化工藝流程

生物發(fā)酵液→陶瓷膜除雜→納濾脫鹽→純化液

陶瓷膜除雜過程主要除去菌體以及大分子蛋白；納濾脫鹽過程主要是對(duì)陶瓷膜的清液進(jìn)行脫鹽、部分脫色以及進(jìn)一步去除小分子蛋白，從而得到丙氨酸純化液。

1.3.2 分析檢測(cè)

透光度：采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定；丙氨酸含量：利用丙醛反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)；通量：采用定時(shí)體積測(cè)量法；磷酸根含量：采用離子色譜進(jìn)行檢測(cè)。丙氨酸收率、丙氨酸截留率及磷酸鹽去除率計(jì)算公式如下：

式中：η1為丙氨酸收率，%；c1為陶瓷膜過濾清液中丙氨酸的質(zhì)量濃度，g/L；V1為陶瓷膜過濾后清液的體積，L；c2為原料液中丙氨酸的質(zhì)量濃度，g/L；V2為原料液的體積，L。

式中：η2為丙氨酸截留率，%；c3為納濾膜處理后清液中丙氨酸的質(zhì)量濃度，g/L；V3為納濾膜處理后收集的清液體積，L；c4為納濾膜處理前料液中丙氨酸的質(zhì)量濃度，g/L；V4為納濾膜處理料液的體積，L。

式中：η3為磷酸鹽去除率，%；c5為納濾膜處理后清液中磷酸根的質(zhì)量濃度，g/L；V3為納濾膜處理后收集的清液體積，L；c6為納濾膜處理前料液中磷酸根的質(zhì)量濃度，g/L；V4為納濾膜處理料液的體積，L。

1.3.3 膜的選型及再生

陶瓷膜通常孔徑范圍在0.1～1.0 μm，主要是截留懸浮微粒、細(xì)菌以及大分子蛋白等物質(zhì)。納濾膜截留分子質(zhì)量范圍在80～1 000 u之間，孔徑為幾個(gè)納米，能對(duì)小分子有機(jī)物、無機(jī)鹽等進(jìn)行分離，能對(duì)溶液脫鹽的同時(shí)實(shí)現(xiàn)溶液的濃縮。

膜的清洗方法大致可分成4類：水力清洗法、機(jī)械清洗法、化學(xué)清洗法和電清洗法，而最常用的是化學(xué)清洗，陶瓷膜一般選用1%硝酸、1%氫氧化鈉和次氯酸鈉交替進(jìn)行清洗；納濾膜一般選用檸檬酸、氫氧化鈉進(jìn)行清洗，并控制清洗液的pH值在2～11。

2 結(jié)果與分析

2.1 陶瓷膜對(duì)加熱前后物料澄清過濾的影響

采用50 nm陶瓷膜過濾同批丙氨酸發(fā)酵液，其中一批經(jīng)80℃高溫滅菌20 min后，陶瓷膜膜過濾過程中溫度控制在60℃；另外一批不經(jīng)高溫滅菌處理，直接用陶瓷膜過濾，溫度控制在35℃，考察丙氨酸發(fā)酵液滅菌前后陶瓷膜滲透通量變化結(jié)果見圖1。

圖1 物料加熱前后對(duì)陶瓷膜通量的影響Fig.1 Effect of the material before or after heating on ceramic membrane flux

對(duì)于同一孔徑的膜過濾通量與溫度、固含量和壓力有關(guān)，其中溫度越高，通量越大。滅菌后物料溫度控制在60℃，比滅菌前的物料溫度高，從圖1中可看出，滅菌后膜過濾通量比滅菌前要高。通過計(jì)算實(shí)驗(yàn)過程中滲透液的體積與過濾時(shí)間的比值，得到膜過濾的平均通量，其中滅菌后膜過濾的平均通量為207 L/（h·m2），滅菌前膜過濾的平均通量為170 L/（h·m2）。此外，不滅菌直接經(jīng)陶瓷膜過濾后的清液中會(huì)發(fā)現(xiàn)有少量絲狀物出現(xiàn)，若加熱煮沸會(huì)出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象；而經(jīng)滅菌后再經(jīng)陶瓷膜過濾后的清液中無絲狀物，即使加熱煮沸也無渾濁的現(xiàn)象出現(xiàn)，可能是少量的小分子質(zhì)量蛋白不能完全被陶瓷膜截留。所以，考慮膜過濾通量和過濾效果，選擇對(duì)丙氨酸發(fā)酵液進(jìn)行80℃滅菌處理20 min，后再經(jīng)陶瓷膜進(jìn)行過濾。

2.2 不同膜面流速對(duì)丙氨酸發(fā)酵液澄清過濾的影響

采用50 nm陶瓷膜過濾同批丙氨酸發(fā)酵液，膜面流速控制在3 m/s、4 m/s、5 m/s時(shí)，考察陶瓷膜滲透液通量變化及丙氨酸收率情況，結(jié)果分別見圖2和表1。

圖2 不同膜面流速對(duì)陶瓷膜通量的影響Fig.2 Effect of different membrane surface velocity on membrane flux

由圖2可知，不同膜面流速過濾同批高溫滅菌后的丙氨酸發(fā)酵液的通量大小順序是：3 m/s＜4 m/s＜5 m/s。由表1可知，隨著膜面流速的增加，陶瓷膜對(duì)丙氨酸未發(fā)生截留，收率為100%；而通量和透光度都有所提高，這是由于過濾過程中，菌絲體和一些大分子蛋白物質(zhì)等在膜面形成凝膠層，若膜面流速越大，流體對(duì)膜表面的凝膠層沖刷越激烈，從而可打散部分凝膠，提高通量。但膜面流速進(jìn)一步增加時(shí)，設(shè)備運(yùn)行和投資成本也會(huì)增加，因此，選擇膜面流速在5 m/s為宜。

表1 不同膜面流速下的陶瓷膜平均通量Table 1 Average flux of ceramic membrane with different cross flow velocity

2.3 不同納濾膜處理前后丙氨酸發(fā)酵液性質(zhì)的變化

取200L同批陶瓷膜處理后的滲透清液，分別采用UA60、XN45、DK納濾膜進(jìn)行過濾，考察不同納濾膜過濾對(duì)處理前后發(fā)酵液的透光率、丙氨酸和磷酸的截留的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，XN45膜處理對(duì)丙氨酸的截留率最少，只有2.6%，但對(duì)磷酸鹽的截留效果低于UA60膜和DK膜；DK膜盡管對(duì)丙氨酸的截留率最多，為17.9%，但對(duì)磷酸鹽的截留效果最好，其中透光提高65.6%，磷酸鹽去除率80.2%；而UA60納濾膜對(duì)磷酸鹽去除率為59.8%，而對(duì)丙氨酸的截留率為10.5%，兩者均介于XN45與DK膜之間。因此，為了保證納濾膜處理后丙氨酸產(chǎn)品的含量，并能獲得膜處理的清液有較好的透光率、且磷酸鹽雜質(zhì)較少，最終選擇UA60納濾膜對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行脫鹽、脫色。

表2 不同納濾膜處理前后丙氨酸發(fā)酵液性質(zhì)的變化Table 2 Change of fermentation broth properties before and after different nanofiltration membrane filtration

2.4 膜清洗

若膜在使用過程中清洗周期不當(dāng)或清洗方式不合適，有可能造成膜不可逆污染，使膜發(fā)生透過流量降低、分離特性變差等現(xiàn)象[16]。因此，在膜清洗時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同污染物的相應(yīng)性質(zhì)，膜組件的材料及污染程度來選擇不同的清洗方式和化學(xué)清洗劑。陶瓷膜清洗選用2%氫氧化鈉和0.5%～1.0%次氯酸鈉在60℃清洗1 h，即可恢復(fù)陶瓷膜初始通量；UA60納濾膜使用檸檬酸將pH控制在2～3，30℃條件下清洗1h，可恢復(fù)納濾膜初始通量。

3 結(jié)論

利用陶瓷膜超濾和納濾工藝從L-丙氨酸發(fā)酵液中提純L-丙氨酸。經(jīng)試驗(yàn)研究表明，發(fā)酵液事先經(jīng)過80℃高溫滅菌20 min，滅菌后再經(jīng)過陶瓷膜進(jìn)行過濾，能有效地去除菌體和大分子蛋白。并確定陶瓷膜過濾的膜面流速控制在5 m/s。并對(duì)納濾膜進(jìn)行選型，最終確定UA60納濾膜對(duì)料液進(jìn)行脫色素、脫磷酸鹽處理，其中透光率提高43.6%，磷酸鹽去除率59.8%，對(duì)丙氨酸的截留率為10.5%。使用膜過濾提純后，L-丙氨酸的總收率為85.9%。該實(shí)驗(yàn)為提取高純度的L-丙氨酸創(chuàng)造了條件。

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