Notch1、Notch2、 Notch3跨膜受體蛋白在淋巴瘤組織中的表達(dá)及意義

邢鴻雁++++++滕清良

[摘要] 目的 探討不同類型淋巴瘤組織中Notch1、Notch2、 Notch3跨膜受體蛋白的表達(dá)規(guī)律。 方法 通過(guò)免疫組織化學(xué)SP技術(shù)，觀察59例淋巴瘤組織和21例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中Notch的表達(dá)水平。 結(jié)果 Notch1在T細(xì)胞淋巴瘤組和NK/T細(xì)胞淋巴瘤組表達(dá)的陽(yáng)性率顯著高于B細(xì)胞淋巴瘤組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。B細(xì)胞淋巴瘤組和NK/T細(xì)胞淋巴瘤組Notch2表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于T細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。NK/T細(xì)胞淋巴瘤組Notch3表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 Notch信號(hào)通路的異?；罨c淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展可能與Notch1、Notch2、Notch3的高表達(dá)有關(guān)；Notch1的高表達(dá)可能在T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用；B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展與Notch2的高表達(dá)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Notch；淋巴瘤

[中圖分類號(hào)] R733.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）12-0005-04

The expression and its significance of Notch1-3 protein in lymphoma

XING Hongyan1，2 TENG Qingliang3

1.Qingdao University Medical College，Qingdao 266000，China； 2.Taishan Nursing Occupation College，Tai`an 271000，China； 3.Department of Hematology，the Central Hospital of Tai'an City in Shandong Province，Tai'an 271000，China

[Abstract] Objective To explore the expression and its significance of Notch1、Notch2、 Notch3 transmembrane receptor protein in different types of lymphoma tissues. Methods By employing immunohistochenistry SP staining，the expressions of Notch in 59 lymphomas were detected， and 21 cases of lymph-node reactive hyperplasia served as control group. Results The expression of Notch1 was significantly higher in T-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the B-cell lymphoma and the control group， the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch2 was obviously higher in B-cell lymphoma and NK/T-cell lymphoma than that in the T-cell lymphoma and the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）. The expression of Notch3 in NK/T-cell lymphoma group was significantly higher than that in the other three groups， the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion Abnormal activation of Notch signaling pathway is closely related to the occurrence and development of lymphoma. The occurrence and development of NK/T-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch1， Notch2 and Notch3； The occurrence and development of T- cell lymphoma is probably related to the high expression of Notch1； The occurrence and development of B-cell lymphoma is probably associated with the high expression of Notch2.

[Key words] Notch；Lymphoma

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）是一組異質(zhì)性很強(qiáng)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，在世界范圍內(nèi)淋巴瘤已成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的排名中僅次于白血病，嚴(yán)重威脅患者生命健康。雖然治療手段，如化療、放療相結(jié)合、生物治療、靶向治療、骨髓或造血干細(xì)胞移植等的綜合運(yùn)用不斷提高，在一定程度上提高了治愈率及生存率，但仍有很大部分惡性淋巴瘤復(fù)發(fā)，其因腫瘤導(dǎo)致的死亡率排名第十位[1]。

因此深入探討淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)。很多研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路不僅在多器官及細(xì)胞的正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)亦與一系列腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，本研究主要檢測(cè)Notch1～3受體蛋白在淋巴瘤組織中的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)規(guī)律，探討其在淋巴瘤發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及來(lái)源

收集泰安市中心醫(yī)院2008年8月～2014年8月的新發(fā)非霍奇金淋巴瘤的病理組織標(biāo)本共59例，所有組織經(jīng)泰安市中心醫(yī)院病理科專家劃分組織學(xué)類型，提出病理診斷。其中B細(xì)胞淋巴瘤39例（彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤23例，濾泡性淋巴瘤5例，小淋巴細(xì)胞淋巴瘤5例，黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤6例），T細(xì)胞淋巴瘤12例（包括血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤2例，間變性大細(xì)胞淋巴瘤3例，外周T細(xì)胞淋巴瘤7例），NK/T細(xì)胞淋巴瘤（鼻型）8例。59例患者中男33例，女26例；中位年齡54.35歲（最小6歲，最大82歲）。同時(shí)收集21例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生的組織標(biāo)本作為對(duì)照組。所有病例均為初發(fā)，未經(jīng)任何抗腫瘤治療及免疫治療等。

1.2主要試劑

跨膜受體蛋白Notch1抗體、跨膜受體蛋白Notch2抗體、跨膜受體蛋白Notch3抗體均購(gòu)自上海安研商貿(mào)有限公司，SP免疫組化檢測(cè)試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物公司。

1.3方法

所有組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定送病理科進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，然后采用免疫組織化學(xué)SP染色法進(jìn)行染色。首先，切片置于60℃烘箱中烘烤過(guò)夜后經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度酒精（濃度遞減）水化，經(jīng)PBS沖洗后將切片再浸入枸櫞酸緩沖液進(jìn)行高溫抗原修復(fù)，PBS沖洗；將3%H2O2溶液滴到切片上，室溫避光孵育20 min，用以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；向組織切片滴加正常非免疫動(dòng)物血清進(jìn)行抗原封閉；滴加一抗（100倍稀釋），4℃過(guò)夜，復(fù)溫后滴加二抗、三抗，再滴加DAB顯色液；蘇木精復(fù)染后，經(jīng)1%鹽酸酒精分化，梯度酒精（濃度遞增）脫水，二甲苯透明，干燥后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

Notch1～3受體蛋白細(xì)胞染色判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]，染色隨機(jī)取5個(gè)高倍（×400）視野，觀察染色陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及染色程度。染色細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。染色強(qiáng)度：未著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色及棕褐色為3分。染色細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)乘以染色強(qiáng)度，通過(guò)得分判斷結(jié)果，0分和1分視為陰性，2分以上為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。4×2表整體進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同病理類型間Notch1、Notch2、Notch3蛋白陽(yáng)性率的兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，用Bonferroni法對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正，校正值為0.008。

2 結(jié)果

2.1 Notch受體蛋白在不同類型淋巴瘤及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中的表達(dá)水平

見(jiàn)表1。Notch受體蛋白免疫組化染色部分主要集中在細(xì)胞膜，部分散在分布于胞漿、胞核中，陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于視野中。

表1 Notch受體蛋白在病理組織中的表達(dá)水平

注：*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.2 Notch受體蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴瘤病理類型的相關(guān)性分析

Notch1受體蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴瘤病理類型的相關(guān)性分析，見(jiàn)表2。Notch1蛋白在T細(xì)胞淋巴瘤組、NK/T細(xì)胞淋巴瘤組、B細(xì)胞淋巴瘤組及對(duì)照組的陽(yáng)性率，分別為83.33%（10/12）、75.00%（6/8）、17.95%（7/39）和9.52%（2/21），T細(xì)胞淋巴瘤組、NK/T細(xì)胞淋巴瘤組Notch1受體蛋白的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。T細(xì)胞淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤Notch1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組的Notch1蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 Notch1蛋白在不同病理類型中陽(yáng)性率的兩兩比較

注：#表示連續(xù)性校正χ2值，*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 Notch2蛋白在不同病理類型中陽(yáng)性率的兩兩比較

Notch2受體蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴瘤病理類型的相關(guān)性分析，見(jiàn)表3。Notch2蛋白在T細(xì)胞淋巴瘤組、NK/T細(xì)胞淋巴瘤組、B細(xì)胞淋巴瘤組及對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為8.33%（1/12）、62.50%（5/8）、58.97%（23/39）和4.76%（1/21），B細(xì)胞淋巴瘤組和NK/T細(xì)胞淋巴瘤組Notch2受體蛋白陽(yáng)性率明顯高于T細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NK/T細(xì)胞淋巴瘤組與B細(xì)胞淋巴瘤組Notch2蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。T細(xì)胞淋巴瘤組與對(duì)照組的Notch2蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 Notch2蛋白在不同病理類型中陽(yáng)性率的兩兩比較

注：#表示連續(xù)性校正χ2值，*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.4 Notch3蛋白在不同病理類型中陽(yáng)性率的兩兩比較

Notch3受體蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴瘤病理類型的相關(guān)性分析，見(jiàn)表4。Notch3蛋白在T細(xì)胞淋巴瘤組、NK/T細(xì)胞淋巴瘤組、B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組的陽(yáng)性率分別為16.67%（2/12）、62.50%（5/8）、5.13%（2/39）和4.76%（1/21），NK/T細(xì)胞淋巴瘤Notch3蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于T細(xì)胞淋巴瘤組、B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T細(xì)胞淋巴瘤組、B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組的Notch3蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表4 Notch3蛋白在不同病理類型中陽(yáng)性率的兩兩比較

注：#表示連續(xù)性校正χ2值，*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 討論

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子（CSL-DNA結(jié)合蛋白）、下游靶基因及其他效應(yīng)物等構(gòu)成。Notch受體是一類結(jié)構(gòu)高度保守的Ⅰ型單鏈跨膜蛋白，人的Notch受體家族包括Notch1～4。Notch受體包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分。Notch信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)已有近百年，大量研究提示其不但涉及所有細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等活動(dòng)，而且Notch信號(hào)通路的異?；罨谀[瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[3，4] 。本研究旨在觀察Notch1、2、3受體蛋白在不同類型淋巴瘤組織中的表達(dá)情況，了解其與淋巴瘤發(fā)生的相關(guān)性，為進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

Notch1在T淋巴細(xì)胞腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，約50%的急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）病例存在Notch1基因點(diǎn)突變或染色體易位，引起Notch1信號(hào)的異?；罨菍?dǎo)致T-ALL的原因之一[5，6]。這與本研究結(jié)果相似，Notch1在T細(xì)胞淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)明顯高于B細(xì)胞淋巴瘤和對(duì)照組，提示Notch1在不同類型淋巴瘤發(fā)生中的作用可能不同，T細(xì)胞淋巴瘤和NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能與Notch1信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān)。

Notch信號(hào)通路在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病中所發(fā)揮的作用仍存在爭(zhēng)議，出現(xiàn)了致瘤和抑瘤兩種相反報(bào)道。本研究結(jié)果顯示Notch1、3受體蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，但Notch2受體蛋白的表達(dá)明顯高于T細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組，提示B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能與Notch2受體蛋白表達(dá)升高有關(guān)。以往研究報(bào)道，Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞、套細(xì)胞淋巴瘤Maver和Z138細(xì)胞可表達(dá)Notch1、Notch2，Raji細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Notch下游靶基因Hes1[7]；有研究發(fā)現(xiàn)約8%彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤和5%邊緣區(qū)淋巴瘤組織標(biāo)本中可檢測(cè)到Notch2的突變[8，9]，提示Notch2突變可能參與了 B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展。相反，Zweidler-McKay PA[10]等研究發(fā)現(xiàn)，Notch2 的持續(xù)活化可抑制B細(xì)胞惡性腫瘤的生長(zhǎng)，激活 Notch/Hes1信號(hào)可能成為治療B細(xì)胞惡性腫瘤的一種新方法。但相關(guān)研究數(shù)量有限，還需繼續(xù)深入研究，累計(jì)資料以明確Notch信號(hào)通路對(duì)B細(xì)胞淋巴瘤的作用。

Notch信號(hào)通路在NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病中的作用研究較少，本研究顯示，Notch1、2、3在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，提示NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能與Notch信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān)，與胡彥偉[11]等的研究結(jié)果有相似之處。但由于總體樣本量小，可能存在抽樣誤差，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究了Notch1～3受體蛋白在不同類型淋巴瘤組織中的表達(dá)情況，提示不同Notch受體蛋白的高表達(dá)可能與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但在不同類型淋巴瘤發(fā)病中所起的作用可能不盡相同。因此，活化或阻斷Notch信號(hào)通路可能成為治療不同類型淋巴瘤的新方法。如王艷芳等[7]研究發(fā)現(xiàn)γ-分泌酶抑制劑DAPT通過(guò)抑制Notch受體信號(hào)通路，對(duì)Jurkat細(xì)胞和Raji細(xì)胞的增殖有明顯的抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，可以將細(xì)胞周期阻滯在G1期，并抑制Notch 通路的下游靶基因Hes1的表達(dá)，但對(duì)Maver和Z138細(xì)胞的作用較弱。Maria 等[12]使用DAPT作用于外周T 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可降低Notch1 表達(dá)量并可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外，shRNA 靶向沉默Notch1 基因表達(dá)可以誘導(dǎo)套細(xì)胞淋巴瘤Jeko-1 細(xì)胞的凋亡[13]。上述研究均為探討淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制及靶向治療措施提供了依據(jù)和參考，并為進(jìn)一步的研究指明了方向。

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（收稿日期：2015-02-14）