茅山地區(qū)蟬花菌株的分離及其多糖生物活性的研究

陳成+許佳偉+孫細(xì)涓+賈俊強(qiáng)+桂仲爭(zhēng)

摘要：對(duì)采自江蘇句容茅山地區(qū)的蟬花進(jìn)行組織分離，獲得1株組織分離菌株，運(yùn)用rNDA ITS區(qū)段對(duì)分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。結(jié)果表明，該菌株為蟲草屬類的被孢霉屬菌株，命名為JR_cds1。蟬花中蟲草素含量顯著高于蠶蛹蟲草和冬蟲夏草。通過(guò)水提醇沉以及Sevage法除蛋白等方法提取蟬花多糖，研究其生物學(xué)活性及抑菌作用，結(jié)果顯示，該蟬花多糖具有較高的清除DPPH自由基活性，高的Fe2+ 螯合能力，抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的活性;對(duì)大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）以及鏈格孢屬真菌顯示較好的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：蟬花;菌株分離;分子鑒定;多糖;抗氧化;抑菌作用

中圖分類號(hào)： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0347-05

收稿日期：2015-01-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201403064）。

作者簡(jiǎn)介：陳 成（1991—），女，碩士研究生，主要從事微生物資源利用研究。Tel：（0511）85616716;E-mail：317657686@qq.com。

通信作者：桂仲爭(zhēng)，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事生物資源功能性利用研究。Tel：（0511）85616716;E-mail：srizzgui@hotmail.com。

蟬花（Ophiocordyceps sobolifera）又稱蟬菌蟬蛹草，是麥角菌科真菌蟬擬青霉寄生竹蟬若蟲后的復(fù)合體，與冬蟲夏草相類似的蟲草[1]，為名貴中藥材。蟬花是從單個(gè)或是2～3個(gè)蟬幼蟲頭部生長(zhǎng)出來(lái)，約3.4 cm長(zhǎng)，從頂端開花分枝（如圖1）。秋季來(lái)臨，蟬鉆入土中，逐漸變成蟬蛹，在羽化前被蟲草類真菌寄生，在適宜的環(huán)境下開始萌發(fā)成菌絲體，吸收蟲體的營(yíng)養(yǎng)，菌絲體從營(yíng)養(yǎng)階段轉(zhuǎn)化為有性階段，漸漸從頂端開花分枝，故而得名蟬花。蟬花主要分布在我國(guó)的四川、江蘇、浙江、福建以及安徽、云南東部。

早在宋代唐慎微的《征類本草》，明朝李時(shí)珍的《本草綱目》以及之后的藥典都有蟬花功效的記載，蟬花的歷史記載比冬蟲夏草早800年，被稱為最古老的蟲草。蟬花與冬蟲夏草同屬于蟲草類中藥材，主要包含的有效成分有：蟲草素、腺苷、蟲草多糖、蟲草酸等;蟬花含有16種氨基酸，其中人體必需氨基酸7種，蟲體與菌座游離氨基酸總量及水解氨基酸含量略低于冬蟲夏草[2]?！侗静菥V目》記載，該菌功同蟬蛻，可止瘧疾;《類證本草》中也提到蟬花能夠主治小兒驚癲、夜啼、心悸等[3]。國(guó)內(nèi)外研究表明，蟬花具有提高免疫力、抗疲勞、保腎、改善、睡眠、抗腫瘤、保肝、抗輻射和明目等多重作用。因此，蟬花可以作為冬蟲夏草的代用品，達(dá)到滋補(bǔ)養(yǎng)生的作用。但天然的蟬花非常稀少，野生金蟬花更稀奇珍貴，這限制了蟬花大量使用。不同地區(qū)不同生態(tài)環(huán)境采集的蟬花分離物，極具物種多樣性，它們?cè)谶z傳和形態(tài)上具有明顯的差異，故蟬花菌株的分離與鑒定是蟬花研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

多糖是由許多單糖聚合而成的天然高分子化合物，是生命有機(jī)體的重要組成部分。已發(fā)現(xiàn)許多真菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的活性起到保護(hù)生物膜和延緩衰老的作用[4]。本研究對(duì)從江蘇省句容市茅山鎮(zhèn)竹林山區(qū)采取的蟬花菌株進(jìn)行分離鑒定，研究蟬花主要活性成分含量、蟬花多糖的抗氧化活性以及對(duì)細(xì)菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）和真菌（鏈格孢屬）的抑菌效果。以明確該蟬花菌株的基本生物學(xué)特性及其多糖的生物學(xué)活性，為進(jìn)一步開發(fā)蟬花提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟬花及試驗(yàn)菌種

野生蟬花采自江蘇省句容市茅山鎮(zhèn)竹林山區(qū)，海拔約 150 m。試驗(yàn)用大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;鏈格孢屬（Alternaria sp.）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從桑椹中分離并保存。

1.2 試劑

腺苷標(biāo)準(zhǔn)品和鼠李糖等為上海化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝，蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自常州大康保健藥品有限公司。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、1，1-二硝基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C、菲洛嗪、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、EDTA均購(gòu)自Bio Basic有限公司。其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

L-7420型高效液相色譜儀（日本東芝高技術(shù)公司）、RF-20A超高靈敏度熒光檢測(cè)器（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）、SY-601型超級(jí)恒溫水?。ㄌ旖蚴袣W諾儀器儀表有限公司）、AL104-IC型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、H205DR-1型高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、WFZ-UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）、無(wú)菌超凈臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、5424型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppenderf公司）、JD-801M型凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）、MG 96G型PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）、GNP9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LRH-250-Z型振蕩培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）、DHG-9143BS型電熱鼓風(fēng)干燥器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）

1.4 蟬花菌株的分離與鑒定

1.4.1 組織分離 將新鮮蟬花分為菌膜、子座、菌核三部分進(jìn)行菌種分離。用滅菌后的解剖刀除去表皮，各部位切成（2～3） mm×（2～3） mm的組織塊，用0.1%的HgCl2溶液浸泡3～4 min，75%乙醇浸泡1 min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水漂洗，無(wú)菌濾紙吸干。置于含氨芐青霉素的PDA平板上，25 ℃倒置培養(yǎng)。待組織塊周邊長(zhǎng)出菌絲后，挑菌落邊緣菌絲，移至新的培養(yǎng)基，純化菌株，獲得蟬花菌株，保存?zhèn)溆?。endprint

1.4.2 菌株的形態(tài)觀察 將分離的菌株分別接種到沙氏、查氏和PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落顏色、大小、形狀及邊緣形狀。在顯微鏡下觀察菌絲有無(wú)隔，分生孢子梗，分生孢子大小、形狀等。

1.4.3 菌株的分子鑒定 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，對(duì)在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d的菌絲球抽提基因組DNA，采用真菌ITS區(qū)擴(kuò)增通用引物。（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC）對(duì)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到 pMD-18T 載體，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。獲得的ITS序列進(jìn)行Blast比對(duì)，利用軟件ClusterX進(jìn)行多重序列比對(duì)，軟件Mega中Neighbour-Joining方法（鄰接法，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)分離菌株與Genebank 數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株的分類地位。

1.5 蟬花主要活性成分的測(cè)定

蟲草素和腺苷的提取與測(cè)定：依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版，采用高效液相色譜法[5-6]。

蟲草酸的提取與測(cè)定：采用分光光度計(jì)法[6-7]。

1.5 蟬花多糖的制備與含量測(cè)定

1.5.1 蟬花多糖的制備 （1）多糖提?。悍Q取100 g蟬花干粉，加2 000 mL水于80 ℃水浴浸提10 h，布氏漏斗抽濾得濾液，連續(xù)浸提2次，合并濾液。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于80 ℃濃縮至一定體積。（2）醇沉：加入無(wú)水乙醇至終濃度為90%，置于4 ℃過(guò)夜，離心得沉淀，將沉淀復(fù)溶于一定蒸餾水中。（3）除蛋白、去離子：用Sevag法除去多糖溶液中的蛋白質(zhì)。再用自來(lái)水和蒸餾水分別透析48 h除去小分子物質(zhì)和部分色素。

1.5.2 蟬花多糖的含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[8]測(cè)定蟬花多糖的含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，于490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)葡萄糖含量與吸光度回歸方程計(jì)算多糖含量。

1.6 蟬花多糖抗氧化活性

1.6.1 清除DPPH自由基能力 參照Luo等的方法[8]并略有調(diào)整。稱取一定量的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），用無(wú)水乙醇配成0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取 2 mL 不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入DPPH溶液2 mL，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測(cè)吸光度。用維生素C作陽(yáng)性對(duì)照。樣品中自由基清除率用下面公式計(jì)算：

清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

式中：D0為2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度;D1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度;D2為2 mL樣品溶液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.6.2 總還原能力 采用Tsais等的方法[9]測(cè)定。在10 mL離心管中分別加入用0.2 mol/L pH值6.6的磷酸緩沖液配制的不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入1%鐵氰化鉀2 mL，混合均勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后加入10%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處測(cè)吸光度。維生素C作陽(yáng)性對(duì)照。

1.6.3 對(duì)Fe2+鐵離子螯合能力 參考Decker等的方法[10]并略有調(diào)整。分別取3 mL不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.05 mL和 5 mmol/L 的菲洛嗪溶液，劇烈振蕩后室溫放置10 min，于 562 nm 處測(cè)吸光度。EDTA為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)Fe2+的螯合率計(jì)算公式如下：

螯合率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

式中：D0為3 mL蒸餾水代替反應(yīng)體系中樣品溶液后的吸光度;D1為樣品溶液反應(yīng)后的吸光度;D2為0.05 mL的蒸餾水代替反應(yīng)體系中FeCl2溶液后的吸光度。

1.6.4 對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制率 將10 μL ACE酶液與10 μL不同濃度（6、12、18、24、30 mg/mL）蟬花多糖提取液混合均勻，對(duì)照組加入10 μL蒸餾水代替蟬花多糖提取液，37 ℃水浴5 min，然后加入濃度為6.5 mmol/L 的HHL（馬尿酰-組氨酰-亮氨酸）反應(yīng)底物（用pH值8.3的硼酸鹽緩沖液配制），37 ℃水浴反應(yīng)30 min，之后加入85 μL 1 mol/L的HCL終止反應(yīng)，再向反應(yīng)混合液中加入1 mL乙酸乙酯，搖勻數(shù)分鐘后，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液800 μL，放入干燥箱里90 ℃烘干后，加入等量的蒸餾水溶解，檢測(cè)D228 nm值?？瞻讓?duì)照在加入HHL底物之前加入85 μL濃度為1 mol/L的HCl，使ACE失活，以后的操作步驟與蟬花多糖提取液的處理一致[11]。

ACE抑制率=[C-（S-B）]/C×100%。

式中：C為未加蟬花多糖提取液對(duì)照組的吸光度;B為空白對(duì)照組的吸光度;S為添加蟬花多糖提取液試驗(yàn)組的吸光度。

1.7 蟬花多糖的抑菌試驗(yàn)

1.7.1 蟬花多糖對(duì)細(xì)菌的抑菌作用 在超凈工作臺(tái)中，將滅菌后的培養(yǎng)基趁熱倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后，用移液槍吸取 0.1 mL大腸桿菌或枯草芽孢桿菌懸液于平板上，用涂布器涂布均勻。用打孔器在上述平板中心的四角對(duì)稱位置，打上大小一致、直徑為6 mm的4個(gè)小孔，分別加入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、抗生素（陽(yáng)性對(duì)照）和無(wú)菌水（陰性對(duì)照）。將上述平板于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～4 d，取出觀察抑菌效果。endprint

1.7.2 蟬花多糖對(duì)真菌的抑菌作用 在超凈臺(tái)中，用無(wú)菌打孔器在培養(yǎng)基平板中心及其四角對(duì)稱位置，打上4個(gè)直徑為6 mm的小孔。平板中心放入鏈格孢屬菌塊，其余4孔分別設(shè)為加入0.1 mL無(wú)菌水的空白對(duì)照、0.1 mL蟬花多糖的試驗(yàn)組2組和0.1 mL抗真菌藥咪康唑的陽(yáng)性對(duì)照。將上述平板于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～4 d，取出觀察抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟬花菌株的分離

將經(jīng)蟬花組織塊接種到PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)多次分離純化培養(yǎng)得到單菌落，并在顯微鏡下觀察菌落特點(diǎn)。蟬花分離初期菌落在PDA培養(yǎng)基上，菌落致密，淺黃色，菌落白色其上布滿白色孢子粉（圖2-A）。分生孢子顯微鏡下觀察呈短柱形（圖2-B）。

2.2 蟬花菌株ITS區(qū)段基因分子鑒定

本試驗(yàn)中采用ITS1、ITS2引物對(duì)蟬花基因組DNA進(jìn)行ITS區(qū)段擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2。PCR擴(kuò)增出的條帶十分明亮，條帶大小在500～750 bp之間，符合ITS1-5.8S-ITS2理論大小，將膠切割，回收，連接載體，轉(zhuǎn)化后搖菌挑斑，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上比對(duì)，下載相鄰種屬ITS序列。

經(jīng)Clustal X1.83軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果和從GenBank中搜索到的相似序列進(jìn)行對(duì)位排列，并輔以人工校對(duì)，系統(tǒng)發(fā)育分析采用MEGA4中的鄰近相鄰法（neighbor-joining;NJ）構(gòu)建、分析，各分支的置信度經(jīng)bootstrap 1 000次循環(huán)檢驗(yàn)各分支的系統(tǒng)學(xué)意義與可靠性。結(jié)合GenBank上的9個(gè)蟲草有關(guān)序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。分枝統(tǒng)計(jì)支持率評(píng)估采用Bootstrap法，自展值為1 000。由圖4可知，所有序列形成2個(gè)大的分支，分離的蟬花菌種與被孢霉屬（Mortierella sp.）以及擬青霉屬（Paecilomyces）、蟬花（Cordyceps sobolifera）構(gòu)成了一個(gè)大的分支。與蟲草屬（Cordyceps）相似度達(dá)到95%，暫命名為 JR_cds1。

2.3 蟬花主要活性成分

蟲草素、腺苷、蟲草酸和多糖等含量是評(píng)價(jià)蟲草類的主要質(zhì)量指標(biāo)。表1為蟬花JR_cds1主要成分含量，其中蟲草素含量達(dá)3.437 mg/g，在所有蟲草類產(chǎn)品中最高。

表1 蟬花菌株JR_cds1主要成分含量

成分 含量（mg/g）

蟲草素 3.437

腺苷 1.251

蟲草酸 57.75

多糖 9.514

2.4 蟬花多糖抗氧化活性

2.4.1 對(duì)DPPH自由基的清除率 DPPH自由基是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，被廣泛用于評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)清除自由基的活性。維生素C是一種抗氧化活性高的還原劑，維生素C常作為抗氧化活性的陽(yáng)性對(duì)照。由圖5中可以看出，隨著多糖濃度增加，對(duì)DPPH自由基清除率也越大。當(dāng)多糖濃度為10 mg/mL時(shí)其清除率達(dá)到88.1 %，接近維生素C的清除率。表明蟬花多糖有良好的清除自由基作用。

2.4.2 蟬花多糖總還原能力 一般來(lái)說(shuō)，物質(zhì)還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，蟬花JR_cds1多糖的總還原能力隨著多糖濃度的增加而提高，總還原能力與多糖濃度呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4.3 蟬花多糖對(duì)Fe2+的螯合能力 一些過(guò)渡金屬離子如Fe2+等極容易通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，觸發(fā)一系列脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而螯合劑則通過(guò)螯合這些過(guò)渡金屬離子來(lái)抑制氧化反應(yīng)。因此， 對(duì)金屬離子螯合能力的測(cè)定是評(píng)價(jià)其抗

氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)[12]。EDTA是常用的螯合劑，常作為陽(yáng)性對(duì)照。由圖7可知，當(dāng)多糖濃度為2～4 mg/mL時(shí)隨著多糖濃度的增加，亞鐵離子螯合率隨之快速提高;隨著多糖濃度的提高其螯合率增加幅度趨緩;當(dāng)多糖濃度為 10 mg/mL 時(shí)，其螯合率達(dá)到54.2 %。

2.4.4 蟬花多糖對(duì)ACE的抑制率 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）可水解血管緊張素Ⅰ羧基端二肽，產(chǎn)生使血壓上升的物質(zhì)——血管緊張素Ⅱ，還可以切除降血壓活性物質(zhì)緩激肽的羧基端二肽，使之失活，因此通過(guò)抑制ACE活性即可實(shí)現(xiàn)降低血壓之目的。目前已有大量抑制ACE活性的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，如食源性的黃酮類蕓香苷和黃連素等[13]。本試驗(yàn)研究了蟬花多糖對(duì)ACE活性的抑制作用，圖8顯示，蟬花多糖對(duì)ACE活性有較好的抑制作用。隨著多糖濃度的增加，其抑制效果逐漸提高，當(dāng)多糖濃度為30 mg/mL時(shí)，其抑制率超過(guò)80%。

2.5 蟬花多糖的抑菌試驗(yàn)

2.5.1 蟬花多糖的抑菌作用 試驗(yàn)比較了革蘭氏陰性菌大腸桿菌（G-）和革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌（G+）與蟬花多糖共培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)效果。由圖9-A可以看出，蟬花多糖對(duì)大腸桿菌有抑制作用，圖中孔1、孔2（蟬花多糖）周圍有明顯抑菌圈，雖然沒有陽(yáng)性對(duì)照青霉素明顯，但相對(duì)無(wú)菌水而

言，效果顯著。圖9-B中3為氯霉素，作為抑制枯草芽孢桿菌的陽(yáng)性對(duì)照，孔1、孔2（蟬花多糖）周圍的細(xì)菌明顯比陰性對(duì)照組（無(wú)菌水）稀少，表現(xiàn)出一定的抑菌性。

2.5.2 蟬花多糖對(duì)鏈格孢屬交鏈孢霉的抑菌作用 試驗(yàn)以31.7 mg/mL的多糖濃度與鏈格孢屬交鏈孢霉共培養(yǎng)，圖10為真菌生長(zhǎng)培養(yǎng)皿的正面圖和背面圖。中央為接種的交鏈孢霉菌塊，在距其中心點(diǎn)2 cm的上、下、左、右處分別用無(wú)菌打孔器打孔。設(shè)抗真菌藥物咪康唑?yàn)殛?yáng)性對(duì)照（孔4），無(wú)菌水為陰性對(duì)照（孔3），孔1和孔2為蟬花多糖。圖10 顯示，菌絲向孔3（無(wú)菌水對(duì)照）方向生長(zhǎng)不受限制，呈弧形;而菌絲向孔1、孔2和孔4方向生長(zhǎng)受到明顯抑制，形成一個(gè)彎弧形，孔4陽(yáng)性對(duì)照與其他試驗(yàn)組差異顯著，表明蟬花多糖對(duì)交鏈孢霉的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。

3 分析與討論endprint

據(jù)報(bào)道，蟬擬青霉的寄主有7種，即竹蟬（Platylomia pieli）、山蟬（Cicada flammata）、蟪蛄（Platyleura kaempferi）、云南黑蟬（Cicadatra shaluensis）、草蟬（Mogannia conica）、小鳴蟬（Oncotympana ella）和透翅蟬（Hyalessa ronsnana），多分布在中國(guó)南方諸省。竹蟬常見于毛竹產(chǎn)區(qū)， 是蟬擬青霉的重要寄

主。此蟲6年1代，每代5齡，常年生活在土壤中，以老齡若蟲最易感病。在氣溫18～24 ℃，相對(duì)濕度大于80%的溫暖濕潤(rùn)季節(jié)，在淺土層活動(dòng)的老齡若蟲接觸帶菌的土壤發(fā)生感染。到翌年6、7月份，溫濕度合適，發(fā)病死亡蟲體前端長(zhǎng)出淺黃色或蛋黃色孢梗束，突破表土，伸向地面，形成蟬花[14]。在江蘇句容茅山地區(qū)生長(zhǎng)著竹林的丘陵地帶（海拔80～200 m），地勢(shì)平緩，土質(zhì)疏松，濕度較大，地面覆蓋有枯枝落葉層，是竹蟬活動(dòng)的主要林地。

真菌基因組DNA包含著一些非編碼基因，如信號(hào)序列、間隔序列，無(wú)功能序列。這些基因在結(jié)構(gòu)、功能和變異程度上差異很大，是真菌在分子水平上研究的良好區(qū)段[15]。其中rDNA ITS序列由于片段小、易于擴(kuò)增，在真菌形態(tài)不同的種間甚至同種的分離菌株間存在高度的差異，因此常用于屬內(nèi)種間或種內(nèi)群體的比較分析[16]。有報(bào)道基于ITS序列的分析比較，從不同地理來(lái)源的蟬花上分離出C.cicadae 和 L. fungicola，說(shuō)明寄生于蟬若蟲并形成蟬花的真菌有2種甚至多種，與蛹蟲草及其無(wú)性型同輪枝菌屬具有密切的關(guān)系[17]。本試驗(yàn)中分離的菌株為被孢霉屬（Mortierella），與蟲草屬（Cordyceps）構(gòu)成了2個(gè)相近的分支?？梢酝茰y(cè)：寄生真菌表型特征的趨同現(xiàn)象、基因水平上的多樣性是寄生真菌為適應(yīng)寄主而產(chǎn)生的結(jié)果[17]。由此可見，本研究分離得到的1株蟲草屬真菌極可能是蟬花菌種的某一無(wú)性型菌株。張傳博等從江蘇省句容市天王鎮(zhèn)磨盤山分離到1株金蟬花，鑒定為大蟬草，也屬蟲草屬，命名為磨盤山金蟬蟲草[18]，該菌株的形態(tài)特征與本研究分離的蟲草屬JR_cds1相似，是否為同一菌屬還有待進(jìn)一步鑒定。

蟬花含有與冬蟲夏草相似或一致的活性物質(zhì)如蟲草素、腺苷、多糖及蟲草酸等。本研究顯示，蟬花中蟲草素的含量（3.437 mg/g）顯著高于蛹蟲草（2.83 mg/g）和冬蟲夏草（003 mg/g），腺苷含量（1.251 mg/g）接近冬蟲夏草 （0.48 mg/g） 的3倍[6，19]，提示蟬花有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，具有開發(fā)利用前景。

多糖為免疫調(diào)節(jié)劑，具有多種生物學(xué)活性。本試驗(yàn)研究了蟬花多糖的抗氧化和抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）的活性。結(jié)果顯示，蟬花多糖具有較好的清除DPPH自由基能力，一定的總還原能力和對(duì)Fe2+ 的螯合能力。其對(duì)Fe2+ 的螯合能力與Wu等研究的蛹蟲草多糖結(jié)果[20]相近。有報(bào)道稱，能清除DPPH自由基的物質(zhì)與其抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力呈一定的正相關(guān)，因此DPPH自由基體系適用于評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物的抗氧化性[21]。王吉標(biāo)等研究了蟬花多糖水提物，結(jié)果顯示，在相同的濃度下，金蟬花正丁醇部位和多糖的總抗氧化性能較強(qiáng)，僅次于維生素C[22]，說(shuō)明蟬花多糖的確有較好的抗氧化性。但不同的提取方法會(huì)影響測(cè)得的結(jié)果。

翁梁采用比濁法研究了野生蟬花多糖與人工蟬花多糖對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，顯示蟬花多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用最為明顯，且抑菌效果與多糖濃度成正比[23]。本試驗(yàn)蟬花多糖對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用的結(jié)果與之吻合。此外，本研究結(jié)果還顯示，蟬花多糖對(duì)真菌的抑制效果明顯優(yōu)于對(duì)細(xì)菌的抑制效果（圖10）。多糖抑制微生物生長(zhǎng)的作用機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道認(rèn)為，杯牛漆多糖對(duì)大腸桿菌的抑制作用是通過(guò)抑制細(xì)胞黏附來(lái)實(shí)現(xiàn)的[24];而紫萁多糖廣譜抗菌性是因?yàn)槎嗵侨芙庑纬傻哪z體溶液能在細(xì)胞表面或膠體表面形成保護(hù)層[25]。蟬花多糖的抑菌作用機(jī)制有待深入研究。

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