藜麥總黃酮的超聲波法提取及抗氧化活性

董晶+張焱+曹趙茹+李志英

摘要：用超聲法探討提取藜麥黃酮的最佳工藝，并測定其自由基的清除能力及對淀粉酶的降解作用。結(jié)果表明，最佳提取條件為：料液比為1 g ∶ 50 mL，乙醇濃度80%，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，超聲功率為240 W。藜麥黃酮提取液對DPPH·、·OH的清除能力分別為89.3%、86.6%，對淀粉酶的抑制率為41.38%。

關(guān)鍵詞：藜麥;黃酮;抗氧化性

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0267-03

收稿日期：2014-05-20

基金項目：忻州師范學院應用化學創(chuàng)新實踐基地（編號：院政字201331）;忻州師范學院大學生科技創(chuàng)新項目（編號：2012.1022）。

作者簡介：董 晶（1992—），從事分析化學研究。

通信作者：李志英，教授，從事分析化學教學與科研工作。E-mail：lizhiying8001@163.com。

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的傳統(tǒng)食物，有7 000多年的種植歷史。聯(lián)合國糧農(nóng)組織認為，藜麥是唯一的單體植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物[1]。藜麥含有豐富的類黃酮物質(zhì)，有助于血液循環(huán)、軟化血管，可明顯促進糖脂代謝、胰島素分泌，對糖尿病有很好的療效。藜麥黃酮具有抗氧化[2]、抗癌及防癌[3]、降壓及降血脂、改善微循環(huán)、抑菌、消炎等功效，是極具開發(fā)前景的天然有機抗氧化劑。本研究對藜麥黃酮的最佳提取條件進行了探究，并研究了其體外清除DPPH·、·OH自由基的能力，旨在為開發(fā)利用藜麥資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

藜麥（山西稼祺農(nóng)業(yè)科技有限公司）。準確稱取 0.020 2 g 蕓香苷標準樣品（北京化學試劑公司），用少量無水乙醇溶解后用80%無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，得0.202 mg/mL蕓香苷溶液。準確稱取5 g硝酸鋁（天津市風船化學試劑科技有限公司），用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，即得5%硝酸鋁溶液。準確稱取0.166 8 g硫酸亞鐵（天津市風船化學試劑科技有限公司），用少量蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中，得6 mmol/L硫酸亞鐵溶液。準確移取0.6 mL 30%過氧化氫（天津市風船化學試劑科技有限公司），定容于1 L容量瓶中，得6 mmol/L H2O2溶液。準確稱量0082 9 g 水楊酸（天津市申泰化學試劑公司），用少量無水乙醇溶解，定容于100 mL容量瓶中，得6 mmol/L水楊酸溶液。準確稱取 19716 mg DPPH·，用無水乙醇溶解定容至250 mL 容量瓶中，得 2×10-7 mol/L DPPH·溶液。其他試劑均為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 主要儀器

UV-2550型紫外-可見分光光度計[日本島津公司（蘇州）]，F(xiàn)A22048電子天平（上海精密科學儀器有限公司），KQ-400KDE型臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），723型分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麥黃酮的提取方法 將新鮮的藜麥置于65 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，粉碎后過60目篩，備用。稱取藜麥粉末2 g置于100 mL錐形瓶中，加入80 mL 80%乙醇溶液，240 W 50 ℃下超聲提取30 min，用80%乙醇溶液定容至100 mL容量瓶中，抽濾，作為待測液[3]。

1.3.2 藜麥黃酮的測定方法 精密稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷標準品0.020 2 g置于燒杯中，用少量的無水乙醇溶解，并用80%乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，搖勻。準確吸取標準樣品0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，分別置于10 mL比色管中，加入5%Al（NO3）31 mL，用80%乙醇溶液定容，搖勻，靜置5 min。在405 nm處測定吸光度。當蕓香苷濃度范圍為4.04～20.2 μg/mL時，與吸光度有良好的線性關(guān)系[4]，得回歸方程：D=0.034 3C+0.010 2，r2=0.999。準確量取稀釋后的提取液0.5 mL，按標準曲線的方法測定其吸光度。黃酮得率（W）計算公式如下：

W=V/（f×m×1 000）×100%。

（1）

式中：V為提取液總體積，f為稀釋倍數(shù)，m為藜麥總質(zhì)量。

1.3.3 藜麥黃酮抗氧化性研究

1.3.3.1 對DPPH·清除率的測定 以最優(yōu)條件提取藜麥黃酮，稀釋、定容，得0.202 mg/mL藜麥黃酮提取液。用無水乙醇分別配制不同濃度藜麥黃酮溶液。在 10 mL 比色管中分別加入待測溶液1 mL與DPPH·溶液 2 mL，混勻，避光靜置 30 min，在 517 nm 處測定吸光度D。每一吸光度平行測定3次，取平均值。清除率計算公式如下：

DPPH·清除率=（D空白-D樣品+D對照）/D空白×100%。

（2）

式中：D空白表示 2 mL 無水乙醇代替待測液得到的吸光度;D對照表示 2 mL 無水乙醇代替待測液得到的吸光度。

1.3.3.2 對羥自由基（·OH）清除率的測定 利用 H2O2對 Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH 并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在 510 nm 下有最大吸光度。準確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的藜麥黃酮提取液置于10 mL比色管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4 、2 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇、2 mL 6 mmol/L H2O2，37 ℃反應30 min，以蒸餾水為參比，在510 nm 下測量各濃度的吸光度[5]。不同濃度藜麥黃酮溶液 1 mL 為黃酮的本底吸收。清除率計算公式如下：endprint

·OH清除率=D0-（Di-Dj）D0×100%。

（3）

式中：D0表示不加提取液時空白溶液的吸光度;Di表示加入提取液時溶液的吸光度;Dj表示不加H2O2提取液本底的吸光度。

1.3.4 降糖作用的測定 α-淀粉酶水解淀粉為還原糖，3，5-二硝基水楊酸DNS與還原糖反應顯示紅棕色，540 nm處比色，定量測定α-淀粉酶的活性。取0.3 mL α-淀粉酶 37 ℃ 預熱5 min，加入0.4 mL 1%淀粉溶液在37 ℃下反應 5 min，加入0.2 mL DNS，沸水浴5 min后，取出冷卻，定容至25 mL，540 nm下測定吸光度[5]。在反應體系中加入不同濃度提取液1 mL，空白對照為不加提取液（以蒸餾水補足）。背景對照為對應濃度的提取液，反應終止后用蒸餾水稀釋定容至25 mL，于540 nm處測其吸光度。抑制劑對α-淀粉酶的抑制率計算公式如下：

抑制率=（1-D3-D4D1-D2）×100% 。

（4）

式中：D1、D2、D3、D4分別為540 nm處空白、空白對照、提取液、背景對照的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度的影響

稱取2 g樣品，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液80 mL，超聲功率240 W 30 ℃超聲輔助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽濾。準確吸取2 mL提取液，測其吸光度，得黃酮得率與乙醇濃度的關(guān)系。由表1可知，黃酮得率隨乙醇濃度的增加而增加，當乙醇濃度達80%時，黃酮得率最大，當乙醇濃度再增大時，黃酮得率開始下降，因此乙醇最佳濃度為80%。

表1 乙醇濃度的選擇

乙醇濃度（%） 黃酮得率（%）

50 0.20

60 0.23

70 0.24

80 0.34

90 0.26

2.2 料液比的影響

稱取2 g樣品，分別加入20、30、40、50、60 mL 80%乙醇，240 W 30 ℃超聲輔助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽濾。準確吸取2 mL提取液，測其吸光度，得黃酮得率與料液比的關(guān)系。由表2可知，黃酮得率隨著料液比的增大而增加，當料液比為1 g ∶ 50 mL時黃酮得率最大，當料液比再增大時，黃酮得率開始下降，因此最佳料液比為1 g ∶ 50 mL。

2.3 提取時間的影響

稱取2 g樣品，加入80 mL 80%乙醇溶液，240 W 30 ℃超聲輔助提取10、20、30、40、50 min，定容至 100 mL 容量瓶中，抽濾。準確吸取2 mL提取液，測其吸光度，得到黃酮得率與

表2 料液比的選擇

料液比（g ∶ mL） 黃酮得率（%）

1 ∶ 20 0.21

1 ∶ 30 0.29

1 ∶ 40 0.33

1 ∶ 50 0.42

1 ∶ 60 0.30

提取時間的關(guān)系。由表3可知，黃酮提取率隨提取時間的增大而增加，當提取時間為30 min時，黃酮提取率最高，繼續(xù)延長提取時間，黃酮提取率下降，因此最佳提取時間為30 min。

表3 提取時間的選擇

提取時間（min） 黃酮得率（%）

10 0.25

20 0.31

30 0.33

40 0.31

50 0.28

2.4 提取溫度的影響

稱取2 g樣品，分別加入80 mL 80%乙醇溶液，分別在30、40、50、60、70 ℃超聲輔助提取30 min，超聲功率240 W，定容至100 mL容量瓶中，抽濾。準確吸取2 mL提取液，測其吸光度，得黃酮得率與提取溫度的關(guān)系。由表4可知，黃酮得率隨提取溫度的增大而增加，當提取溫度為50 ℃時黃酮得率最大，再增加提取溫度，黃酮得率開始下降，因此最佳提取溫度為50 ℃。

表4 提取溫度的選擇

提取溫度（℃） 黃酮得率（%）

30 0.21

40 0.27

50 0.32

60 0.29

70 0.28

2.5 超聲功率的影響

稱取2 g樣品，分別加入80 mL 80%乙醇溶液，30 ℃分別在160、200、240、280、320 W功率下超聲輔助提取30 min，定容至100 mL容量瓶中，抽濾。準確吸取2 mL提取液，測其吸光度，得黃酮得率與超聲功率的關(guān)系。由表5可知，黃酮得率開始隨超聲功率的增大而增加，當功率為240 W時黃酮得率最大，再增大超聲功率，黃酮得率下降，因此最佳超聲功率為240 W。

表5 超聲功率的選擇

超聲功率（W） 黃酮得率（%）

160 0.26

200 0.28

240 0.34

280 0.31

320 0.29

2.6 機理探討

準確吸取蕓香苷標準品溶液、藜麥黃酮提取液各2 mL，分別置于10 mL比色管中，各加入1 mL Al（NO3）3溶液，振蕩，用80%乙醇溶液定容，搖勻，靜置5 min。用紫外可見分光光度計確定最大吸收波長。在300～600 nm波長范圍內(nèi)掃描，得標準品、提取液的吸收光譜。由圖1可知，標準品配合物、提取液配合物的最大吸收波長均為405 nm，故本試驗用該波長作為測定波長。

2.7 藜麥黃酮抗氧化性endprint

2.7.1 藜麥黃酮對DPPH·的清除作用 DPPH自由基有單電子，在517 nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色。當藜麥黃酮存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受電子數(shù)量成定量關(guān)系。由表6可知，藜麥黃酮對DPPH·清除效果明顯，在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，在25 μg/mL時有最大清除率（893%），說明藜麥黃酮對DPPH·有很好的清除作用。

表6 藜麥黃酮對DPPH·的清除作用

藜麥黃酮質(zhì)量濃度

（μg/mL） 清除率

（%）

5 22.8

10 39.7

15 56.8

20 79.3

25 89.3

30 89.3

2.7.2 藜麥黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用 羥基自由基是一種化學性質(zhì)極強的活性分子，也是危害最大的自由基之一。由表7可知，藜麥黃酮對羥自由基（·OH）清除效果明顯，在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，當質(zhì)量濃度達20 μg/mL時，清除率最大，說明藜麥黃酮對羥自由基（·OH）有很好的清除作用。

2.7.3 藜麥黃酮提取液對α-淀粉酶的抑制作用 分別取2、3、4 mL提取液， 計算抑制率。由表8可知， 藜麥黃酮提取

表7 藜麥黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用

藜麥黃酮質(zhì)量濃度

（μg/mL） 清除率

（%）

5 19.7

10 25.6

15 55.9

20 86.6

25 86.6

30 86.5

表8 藜麥黃酮提取液對α-淀粉酶的抑制作用

黃酮體積（mL） 抑制率（%）

2 37.26

2 37.93

3 32.14

3 29.41

3 33.33

4 41.38

液對α-淀粉酶有抑制作用，且其濃度與抑制率正相關(guān)。

3 結(jié)論

本試驗研究了超聲輔助法提取藜麥中黃酮的提取工藝，結(jié)果表明，超聲波法的最佳提取條件為：料液比1 g ∶ 50 mL，乙醇濃度80%，提取溫度50 ℃，提取時間30 min，超聲功率240 W。藜麥黃酮對DPPH·、羥自由基（·OH）具有較強的清除作用。本試驗證實了黃酮具有清除自由基、抗氧化的功效，是一種有效的自由基清除劑。

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