馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病研究進(jìn)展

李萌萌+陳士華+吳興泉

摘要：馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑?。╬otato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD）是新發(fā)現(xiàn)的一種馬鈴薯病毒病，可引致馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑，不但降低馬鈴薯產(chǎn)量，而且影響馬鈴薯品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來該病害在中國雖有報道，但相關(guān)研究仍處于起步階段。對PTNRD的癥狀、分布、病原及其分子特征、鑒定方法、病毒與寄主互作關(guān)系及病害防治等方面的新進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為我國深入開展相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病;分布;PVY株系;病毒-寄主互作

中圖分類號： S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0143-04

收稿日期：2014-10-26

基金項目：河南省高校科技創(chuàng)新人才支持計劃（編號：2012HASTIT016）。

作者簡介：李萌萌（1988—），女，河南偃師人，碩士研究生，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：limm882013@126.com。

通信作者：吳興泉，博士，教授，主要從事植物病毒學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：wuxq70@126.com。

馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑?。╬otato tuber necrotic ringspot disease，PTNRD）是由馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）新變異株系引起的一種馬鈴薯病害。PTNRD可在馬鈴薯塊莖的內(nèi)部或外部引起弧狀或環(huán)狀壞死斑，嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價值。PTNRD的發(fā)現(xiàn)使得PVY被認(rèn)為是當(dāng)前馬鈴薯上危害最重的病毒[1]，有關(guān)PTNRD的相關(guān)研究也成為PVY研究中的熱點(diǎn)問題。在過去的20～30年間，PTNRD幾乎席卷整個歐美，危害嚴(yán)重。在中國PTNRD雖然已有報道，但仍非常少[2-3]，說明該病害仍處于低水平發(fā)生階段?，F(xiàn)在應(yīng)該下大力氣研究建立快速準(zhǔn)確的病害檢測技術(shù)，并應(yīng)用于馬鈴薯種薯的檢測檢疫中，以確保對該病害實(shí)施有效預(yù)防和控制。一旦對病害的防控不力、導(dǎo)致病害大范圍擴(kuò)散流行，將會嚴(yán)重影響我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，到時再進(jìn)行防治將會變得非常困難。然而我國關(guān)于PTNRD的研究還非常缺乏，很多問題須開展深入研究。

1 PTNRD的癥狀、分布與危害

1.1 PTNRD的癥狀

PTNRD是危害馬鈴薯的一種病害，在馬鈴薯塊莖表面引起難看的壞死環(huán)斑。感染PTNRD的馬鈴薯塊莖形成壞死環(huán)斑的整個過程是最初在表面出現(xiàn)向外凸起的淺淺的環(huán)或半環(huán)，然后環(huán)向內(nèi)凹陷并且逐漸形成壞死斑。塊莖壞死環(huán)斑的表皮先壞死，然后鄰近環(huán)斑的表皮開始壞死，表皮壞死嚴(yán)重時塊莖表面開始裂開，進(jìn)而塊莖表面深深地裂開，塊莖的壞死癥狀可逐漸延伸至整個馬鈴薯塊莖。由于馬鈴薯塊莖埋于地下，因此只有到收獲后，塊莖上的癥狀才能被發(fā)現(xiàn)，一般隨著儲藏時間的延長病害癥狀會逐漸加重。

馬鈴薯Igor品種是對PVYNTN（PVY塊莖壞死株系）最易感病的品種，癥狀也最明顯。Igor品種的馬鈴薯在感病后所有塊莖均可產(chǎn)生壞死癥狀，葉片在接種數(shù)天后也可產(chǎn)生壞死斑（局部斑）;隨著病毒在體內(nèi)的移動，非接種葉也會出現(xiàn)皺縮、褪綠花葉癥狀。發(fā)病葉片上可出現(xiàn)類似棕櫚樹狀的葉片下垂癥狀[4]。葉片發(fā)病部位細(xì)胞中的葉綠體膨脹，類囊體的結(jié)構(gòu)變松弛，而在壞死斑周圍細(xì)胞中的葉綠體體積變小[5]。

馬鈴薯感染PTNRD后的癥狀表現(xiàn)具有多變性，一般在田間約30%～50%的帶毒塊莖不表現(xiàn)PTNRD癥狀，在馬鈴薯葉片上的癥狀表現(xiàn)也比較輕，大多數(shù)難以識別。有時將田間表現(xiàn)PTNRD癥狀的病毒樣本接種溫室條件下栽培的馬鈴薯后不表現(xiàn)癥狀[6]。

1.2 PTNRD的分布與危害

PTNRD于20世紀(jì)80年代在匈牙利首次發(fā)現(xiàn)，隨后在南斯拉夫、德國、丹麥、法國、比利時、黎巴嫩、澳大利亞、美國、墨西哥、中國、日本等國家相繼報道，可見其傳播速度迅速。PTNRD可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，主要表現(xiàn)在兩個方面：一是感病馬鈴薯塊莖變小，導(dǎo)致產(chǎn)量下降;二是導(dǎo)致馬鈴薯塊莖出現(xiàn)壞死環(huán)斑而無法食用，一般50%～90%的發(fā)病馬鈴薯塊莖都無法銷售，從而嚴(yán)重降低了馬鈴薯的經(jīng)濟(jì)價值[1-3，7-11]。

2 引致PTNRD的PVY株系及其分子特征

2.1 引致PTNRD的PVY株系

PTNRD是由PVY特定株系侵染馬鈴薯所致，PVY具有多種不同的株系類型，研究證明，引起PTNRD的PVY株系多為PVYNTN、PVYN-Wi、PVYN：O株系，另外PVYO、PVYZ株系中的少數(shù)分離物也能誘導(dǎo)一些馬鈴薯品種產(chǎn)生PTNRD[12-15]。Chikh等在敘利亞馬鈴薯產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了1株新的重組株系PVYNTN-NW也能誘導(dǎo)PTNRD[16]。雖然引起PTNRD的株系很多，但目前人們普遍接受和研究比較多的是PVYNTN、PVYN-Wi、PVYN：O株系。

PVYNTN株系在馬鈴薯上可引起典型的PTNRD癥狀，在普通煙上可引起脈壞死癥狀，可與PVYN株系的單克隆抗體反應(yīng)。PVYN-Wi、PVYN：O株系在煙草和馬鈴薯上引起與氮株系相似的癥狀，卻不能與PVYN株系的單克隆抗體反應(yīng)，而與PVYO株系的單克隆抗體反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，它們具有PVYO典型的外殼蛋白基因，所以具有O的血清型。PVYN-Wi、PVYN：O株系可引起非典型的PTNRD癥狀（與PVYNTN 株系相比癥狀較輕）。有研究表明，PVYNTN、PVYN-Wi、PVYN：O株系更具擴(kuò)散性，比PVYO株系更具侵染性，例如它們的蚜傳能力明顯高于PVYN和PVYO株系，而且都可以侵染3個新發(fā)現(xiàn)的PVY寄主：天竺葵（Geranium pusillum）、芹葉太陽花（Erodium cicutarium）、野象草（Lamium purpureum ）[17]。從1984至2004年，PVYN-Wi株系在PVY的研究中一直占主導(dǎo)地位，1994年以來，PVYN、PVYNTN株系的研究逐漸變得流行起來，至2004年，PVYN和PVYNTN株系研究已經(jīng)達(dá)到高峰。endprint

2.2 PVYNTN株系的分子特征

研究表明，PVYNTN株系的不同分離物間存在較高的分子變異，引發(fā)的PTNRD癥狀也不完全相同[18]。如果依據(jù)歐洲PVYNTN分離株系的P1基因序列作為引物進(jìn)行RT-PCR，不能擴(kuò)增出南美洲PVYNTN分離株系。日本的PVYNTN分離物與歐洲的PVYNTN分離物間外殼蛋白基因序列差異明顯，存在明顯的地域特征[8，19]。

PVYNTN株系基因組中在P1、HC-Pro/P3、 Vpg、CP的羧基端可能具有4個重組位點(diǎn)[19]，多數(shù)含有3個重組位點(diǎn)，少數(shù)含有4個重組位點(diǎn)。絕大多數(shù)PVYNTN株系分離物的基因組在8 611位為G，而其他PVY株系在相同位置為A。研究證明，PVYNTN株系在外殼蛋白基因區(qū)存在的重組位點(diǎn)與PTNRD引起的癥狀在某些情況下是相關(guān)的。但也有研究發(fā)現(xiàn)，許多引起PTNRD的PVYNTN分離物外殼蛋白基因中沒有重組位點(diǎn)[8]，說明外殼蛋白基因中不一定包含與PTNRD相關(guān)的序列決定區(qū)，單純依據(jù)外殼蛋白基因的序列對PVYNTN株系進(jìn)行鑒定是不可靠的。

Nie等在2003年研究發(fā)現(xiàn)，1株可引起塊莖壞死的PVYNTN株系分離物是通過基因突變產(chǎn)生的，這種非重組型的PVYNTN株系與南美洲的PVYN株系在基因組結(jié)構(gòu)方面沒有株系特異性區(qū)別[14]。

2.3 PVYN-Wi和PVYN：O株系的分子特征

分析PVYN-Wi和PVYN：O株系的核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，它們是由PVYO株系和PVYN（NTN）株系通過基因重組形成的新株系，其基因組中包含PVYO株系和PVYN株系的基因組片段。在5′和3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)域、外殼蛋白和P1蛋白基因的序列區(qū)，PVYN-Wi株系和PVYN株系是完全不同的。近幾年有研究認(rèn)為，PVYN-Wi和PVYN：O株系的遺傳特性及生物學(xué)特性幾乎完全相同，因此建議將這2個株系合并為1個株系[10，20-21]。但依據(jù)PVYO株系基因序列建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，PVYN-Wi和PVYN：O株系基因組所包含的PVYO株系基因片段分別來自PVYO株系的2個不同分支，PVYN-Wi株系所包含的PVYO株系基因片段來自PVYO株系，而PVYN：O株系所包含的PVYO株系基因片段來自PVYO-O5株系，由此可見，PVYN-Wi和PVYN：O株系在基因序列上仍存在較為明顯的分子差異[22]。

3 PTNRD的鑒定方法

對引致PTNRD病原的有效鑒定是病害防治的關(guān)鍵。近年來，可引起PTNRD的PVY分離物越來越多地被鑒定出來，它們彼此間存在著非常大的分子差異，因此，須要對PTNRD相關(guān)PVY株系的檢測技術(shù)（生物學(xué)方法、血清學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等）的可靠性和準(zhǔn)確性進(jìn)行評估。

3.1 生物學(xué)方法

目前，在PTNRD的鑒定方法中傳統(tǒng)生物學(xué)方法可能是最準(zhǔn)確的，一般PTNRD可在馬鈴薯塊莖上產(chǎn)生壞死環(huán)斑癥狀，另外PVYNTN株系在馬鈴薯葉片上也可引起比PVYN株系更為嚴(yán)重的萎黃色環(huán)斑，因此利用此癥狀特點(diǎn)即可判斷為PTNRD。但是在馬鈴薯生長發(fā)育期PTNRD引致的葉部癥狀有時不明顯，而且在塊莖上也可能隱癥，通過觀察馬鈴薯的癥狀表現(xiàn)無法做出準(zhǔn)確的判斷，只有在收獲后或者已經(jīng)儲藏一段時間后才可能觀察到PTNRD癥狀，這種鑒定方法所需時間長，不適合快速檢測。另外，引致PTNRD的PVY株系種類具有多樣性，而且相同株系在不同馬鈴薯品種和不同環(huán)境條件下引致的病害癥狀變化也較大，采用生物學(xué)鑒定方法也存在一定的不確定性。

3.2 血清學(xué)方法

血清學(xué)方法是利用具有株系特異性的單克隆抗體，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等免疫學(xué)方法來鑒別PVY不同株系[23]。目前，利用單克隆抗體可有效區(qū)分PVYO/C株系和PVYN株系。但PVYNTN和PVYN具有相同的血清型，PVYNW和PVYO具有相同的血清型，Hu 等在中國發(fā)現(xiàn)的2個PVYNTN 分離物（HN1、HN2）可分別與PVYN、PVYO/C 型抗體反應(yīng)[3]，由此可見，單獨(dú)采用血清學(xué)技術(shù)無法對引致PTNRD的PVY進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。

3.3 分子生物學(xué)方法

在PVY檢測鑒定中應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)很多，包括一步RT-PCR、雙重或多重RT-PCR、PCR-RFLP、AmpliDet RNA技術(shù)和SNaPshot技術(shù)等[24-26]。這些技術(shù)多以RT-PCR技術(shù)為核心，依據(jù)PVY基因組5′末端、3′末端或外殼蛋白基因序列差異或是以全基因組序列差異為基礎(chǔ)建立起來的[27-28]。例如以P1基因中的序列變異為基礎(chǔ)建立的鑒定方法已經(jīng)允許作為PVYO或PVYN/NTN株系的最初分類方法，可從正常的PVYO株系中辨別出潛在的誘導(dǎo)PTNRD的株系。多重 RT-PCR 技術(shù)能檢測幾個PVY株系的混合感染，進(jìn)而建立可區(qū)分PVYNTN 株系和 PVYN：O 株系的鑒定技術(shù)[29]。雖然分子生物學(xué)技術(shù)最初在PVYN-Wi株系和PVYNTN株系的檢測中具有很好鑒定效果，但是隨著可引致PTNRD的PVY株系越來越多地被鑒定出來，確定PVY塊莖壞死誘導(dǎo)株系變得越來越困難。

4 馬鈴薯與PVYNTN互作關(guān)系

4.1 馬鈴薯感染PVYNTN后的基因表達(dá)差異

目前，PVY誘導(dǎo)馬鈴薯產(chǎn)生PTNRD的精確調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但已有研究證明，病毒在寄主體內(nèi)復(fù)制時可以引起寄主基因表達(dá)停止。馬鈴薯感染PVYNTN后，光合作用相關(guān)基因、參與信號識別及防御反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯異常[30]，熱激相關(guān)蛋白、過氧化氫酶、β-1，3-葡聚糖酶等基因表達(dá)水平發(fā)生變化[31]。如果在抗病馬鈴薯品種中轉(zhuǎn)入并過表達(dá)Ⅲ型β-1，3-葡聚糖酶基因，可導(dǎo)致病毒的傳播、增殖速度加快[32]。在PVYNTN侵染的晚期，在感病馬鈴薯品種中總蛋白含量增加，而在耐病或中度耐病的馬鈴薯品種中未觀察到此現(xiàn)象[33]。endprint

4.2 馬鈴薯感染PVYNTN后的病理、生理反應(yīng)

PVYNTN在侵染馬鈴薯感病品種時，隨著癥狀的發(fā)展寄主體內(nèi)的細(xì)胞激動素水平發(fā)生變化[34]。在顯癥的接種葉片上，葉綠體的結(jié)構(gòu)和大小出現(xiàn)變化[5]，葉綠素水平下降，可溶性離子結(jié)合型過氧化物酶的活力改變[35]。在侵染24 h后水楊酸的水平明顯增加[36]，在水楊酸耗盡時PVYNTN可引起馬鈴薯產(chǎn)生明顯的發(fā)病癥狀，而在噴施水楊酸的處理中不會發(fā)病，說明水楊酸在病毒的增殖、癥狀發(fā)展過程中具有重要作用[37]。

4.3 PVYNTN-NW侵染性cDNA克隆的構(gòu)建

2011年，Chikh等依據(jù)PVYNTN-NW株系（SYR-II-2-8）構(gòu)建了PVY侵染性cDNA克隆，該侵染性克隆可在馬鈴薯上產(chǎn)生PTNRD癥狀，在普通煙上引起脈壞死癥狀，與接種PVYNTN所產(chǎn)生的癥狀相同。該侵染性克隆的建立可為從分子水平上研究PVY-馬鈴薯間的互作關(guān)系提供重要的技術(shù)支撐[38]。

5 PTNRD的防治

采用脫毒種薯生產(chǎn)、加強(qiáng)種薯檢疫、防治田間傳毒介體等措施仍是防治PTNRD的主要方法。另外Dolnicˇar等研究了不同的儲存溫度對PTNRD壞死癥狀發(fā)展的影響發(fā)現(xiàn)高溫可以促進(jìn)塊莖壞死，延長低溫儲存時間可以延緩塊莖壞死的發(fā)生，降低壞死塊莖的數(shù)量。如果將收獲后的塊莖在低溫下儲存21周后再轉(zhuǎn)入高溫保存也不會產(chǎn)生壞死癥狀，即低溫儲存超過一定時間后病害被完全抑制[39]。

6 討論

已有的研究表明，PTNRD正在世界范圍內(nèi)快速蔓延，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。分析原因可能與以下3個方面有關(guān)：（1）在田間感病馬鈴薯的地上部癥狀輕微，不容易被發(fā)現(xiàn);（2）在馬鈴薯種薯生產(chǎn)過程中對該病害的檢測不及時，存在滯后性;（3）引致PTNRD的PVY株系傳播效率更高，使其在PVY群體中所占有比例不斷擴(kuò)大。上述原因最終導(dǎo)致該病害在人們不知不覺中快速擴(kuò)散、蔓延。

不同條件下PTNRD的癥狀表現(xiàn)不同，有時隱癥，有時輕重不一，這種癥狀多樣性的原因可能與以下3個因素有關(guān)。（1）植物基因型：不同的馬鈴薯品種具有不同的基因型，病毒侵染后的癥狀表現(xiàn)不同;（2）病毒基因型：PVY不同株系侵染馬鈴薯后產(chǎn)生的PTNRD癥狀不同，一般PVYNTN株系侵染后的癥狀表現(xiàn)最重;（3）環(huán)境條件：不同的溫度條件和生長條件下以及不同的塊莖儲藏條件都會影響塊莖壞死的程度。總體來看，PTNRD應(yīng)該是特定的PVY變異株系侵染特定的馬鈴薯品種后在一定的環(huán)境條件下形成的，以上3個因素均可對病害的形成產(chǎn)生影響。

目前，關(guān)于PTNRD形成的分子機(jī)制尚未完全清楚，PVY基因組中與PTNRD形成相關(guān)的基因位點(diǎn)尚未明確，導(dǎo)致對PTNRD病原的鑒定方法還不完善，也影響了對病害的監(jiān)控，給病害防治帶來風(fēng)險，因此建立快速、準(zhǔn)確的病害檢測、監(jiān)控體系將是未來研究的重點(diǎn)。

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