結(jié)核分枝桿菌T7噬菌體展示基因組DNA文庫的構建與鑒定

曾焱華,王 麗，劉海燦，游曉攏，鄧湘贏，萬康林

結(jié)核分枝桿菌T7噬菌體展示基因組DNA文庫的構建與鑒定

曾焱華1,王 麗1，劉海燦2，游曉攏1，鄧湘贏1，萬康林2

目的 利用T7噬菌體作為載體，構建結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA文庫。方法 提取MTB的基因組DNA，用EcoR I和Hind III進行雙酶切，以對基因組DNA進行片段化，并在其末端加上定向的EcoR I和Hind III黏性末端，用DNA片段純化分離柱除去小于200 bp的片段和多余接頭。將DNA片段與T7 10-3b噬菌體連接，經(jīng)包裝蛋白進行包裝后轉(zhuǎn)入BLT5403宿主菌以構建T7噬菌體展示基因組DNA文庫，并檢測文庫的滴度和隨機性。結(jié)果 成功提取到較高質(zhì)量的MTB基因組DNA；構建的T7噬菌體展示基因組DNA文庫的滴度約為6×106pfu/cm3；用PCR檢測結(jié)果表明，在隨機挑取的16個噬菌斑中，其重組率為100%，且插入片段都介于250～2 000 bp左右。結(jié)論 成功構建了MTB T7噬菌體展示基因組DNA文庫，為從基因組范圍篩選MTB的優(yōu)勢抗原奠定了前期實驗基礎。

結(jié)核分枝桿菌；基因組DNA；T7噬菌體展示文庫

Supported by the Major Project of National Science and Technology(No. 2013ZX10003006-002) and the Hunan Provincial Cooperative Innovation Center for Molecular Target New Drug Study(No.2014-405) Corresponding authors: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是1882年由德國科學家Robert Koch首次分離培養(yǎng)出來的一種病原體，由其引起的結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種人獸共患慢性傳染病[1]。在2012年召開的Euroscion結(jié)核病峰會上，Maitra A報道2012年全球約有新發(fā)TB患者860萬病例，其中130萬例死于TB[2]。因此，TB成為全球公共衛(wèi)生安全的重大威脅，是傳染病中僅次于艾滋病的第二大殺手。卡介苗(Bacillus almette-Guerin，BCG)是目前唯一可用于人群免疫的TB疫苗，但其保護效果不太明顯(保護率為0%～80%)，且具有明顯的地區(qū)性差異[3]，因此，研究新型、安全、有效的TB疫苗迫在眉睫。

噬菌體展示技術(Phage display technology)通過將編碼外源目的多肽或蛋白的DNA序列插入到噬菌體特定的衣殼蛋白基因中，使目的多肽或蛋白與噬菌體衣殼蛋白以融合蛋白形式呈現(xiàn)在噬菌體表面，經(jīng)表型篩選即可獲得編碼外源目的多肽或蛋白的DNA序列[4]?；谑删w展示技術發(fā)展起來的噬菌體展示基因組DNA文庫具有高通量淘選、易于純化等諸多優(yōu)點，已被廣泛應用于優(yōu)勢抗原或表位篩選、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和配體-受體研究等領域[5]。

本研究擬提取MTB的基因組DNA，利用T7噬菌體做為載體，構建成MTB的基因組DNA文庫，并對文庫的庫容和重組率等進行檢測，以便為從全基因組范圍篩選MTB的免疫優(yōu)勢抗原，豐富TB的診斷與疫苗候選抗原奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 主要材料 T7 Select system試劑盒、EcoRI/Hind III接頭(5′-GCTTGAA TTCAAGC-3′)、T7篩選前引物(T7 Select UP Primer：5′-GGAGCTGTCGTA TTCCAGTC-3′)和T7 篩選后引物(T7 Select DOWN Primer：5′-AACCCCTCAA GACCCGTTTA-3′)均為美國Novagen公司產(chǎn)品；DNA片段純化分離柱為美國Biomiga公司產(chǎn)品。

1.2 MTB基因組DNA的提取 采用CTAB(溴代十六烷基三甲胺)法提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組DNA(由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所國家結(jié)核病參比實驗室完成)，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，再用核酸蛋白測定儀(DU640，美國Backman公司)檢測其OD260與OD280的比值。

1.3 基因組DNA的片段化與末端處理 將T4多聚核苷酸激酶磷酸化的EcoR I/Hind III接頭用T4 DNA連接酶連接在基因組DNA的兩端,再用EcoR I和Hind III進行雙酶切以使基因組DNA片段化，用DNA片段純化分離柱去除酶切產(chǎn)物中小于200 bp的片段和多余接頭。

1.4 T7載體連接與體外包裝 將大于200 bp的MTB基因組DNA片段用T4連接酶與T7 10-3b 載體臂于16 ℃連接過夜，將5 μL連接產(chǎn)物加入到25 μL T7 Select Packaging Extract包裝蛋白中，于22 ℃孵育2 h以進行噬菌體的體外包裝，加入LB 培養(yǎng)基終止包裝反應。

1.5 宿主轉(zhuǎn)染 將包裝產(chǎn)物與培養(yǎng)到對數(shù)生長期(OD600=0.6～1.0)的宿主菌BLT5403充分混合，加入事先預溫到50 ℃左右的頂層瓊脂(含0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、1%胰蛋白胨和0.6%瓊脂)并迅速混勻，將其倒入到LB固體培養(yǎng)基(含0.5%酵母提取物、0.5%NaCl、1%胰蛋白胨和1.5%瓊脂)中，適當傾斜使其鋪平，凝固后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h。向平皿中加入10 mL抽提緩沖液(100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，6 mmoL/L MgSO4，pH8.0)于4 ℃孵育過夜。將培養(yǎng)產(chǎn)物與抽提緩沖液反復振蕩、吹吸后轉(zhuǎn)入離心管，加入氯仿(每10 mL抽提緩沖液中加入0. 5 mL氯仿)重懸，10 000 r/min 離心5 min，收集上清即為構建好的MTB基因組DNA文庫，按1/ 10體積向其中加入80%滅菌甘油，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 文庫的滴度測定 取10 μL構建好的T7噬菌體展示MTB基因組DNA文庫，用Tris緩沖液(TBS)進行10～105梯度稀釋，分別取10 μL不同稀釋度的噬菌體文庫加入到BLT5403培養(yǎng)物(OD600=1.10)中并充分混合，將其迅速鋪于LB固體培養(yǎng)基中，鋪平并凝固后置于37 ℃培養(yǎng)3～4 h，計數(shù)噬菌斑并計算出文庫滴度。

1.7 文庫的重組率與隨機性檢測 從用于滴度測定的平板上隨機挑取16個單個噬菌斑于滅菌Ep管內(nèi)，向管內(nèi)加入適量的 EDTA緩沖液(10 mmol/L，pH=8.0)，旋渦振蕩30 s，置于65 ℃水浴箱孵育10 min，冷卻后4 ℃離心3 min(12 000 r/min)以去除沉淀，上清液即為噬菌體裂解液。以2.0 μL噬菌體裂解液為模板，用試劑盒提供的T7 Select引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTB基因組DNA的提取與檢測 對提取的MTB基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖1所示，在靠近加樣孔處出現(xiàn)的清晰條帶為MTB的基因組DNA，圖中還出現(xiàn)了一些彌散條帶，這可能是由于在DNA提取和運輸過程中導致基因組DNA斷裂所致，但由于構建文庫時需要將基因組DNA片段化，因此這并不影響后續(xù)文庫的構建。用核酸蛋白測定儀檢測基因組DNA的OD260/OD280，結(jié)果其比值為1.92，說明提取的DNA質(zhì)量較好，可用于文庫構建。

M: DNA Marker; 1: Genomic DNA; 2: Blank control.

圖1 MTB基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳

Fig.1Agarose gel electrophoresis of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.2 MTB基因組DNA的片段化 利用EcoR I和Hind III對MTB基因組DNA進行雙酶切后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，如圖2所示：基因組DNA經(jīng)片段化后主要顯示為彌散的條帶。

M: DL 5 000 Marker; 1: Fragments of MTB genomic DNA.

圖2 MTB基因組DNA的片段化

Fig.2 Fragmentation of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.3 MTB基因組DNA片段的分離純化 用DNA片段純化分離柱去除小于200 bp的短片段和短的接頭，從經(jīng)片段化的MTB基因組DNA中分離純化出大于200 bp的DNA片段，用于T7噬菌體展示基因組DNA文庫的構建。如圖3所示，經(jīng)片段化分離后，主要保留了約250～4 000 bp之間的DNA片段。

M: DL 5 000 Marker; 1: Isolated and purified fragments of genomic DNA; 2: Blank control.

圖3 MTB基因組DNA的片段分離與純化

Fig.3 Isolation and purification of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosis

2.4 MTB基因組DNA文庫具有較高的庫容 按照T7 Select system試劑盒說明書成功構建T7噬菌體展示MTB基因組DNA文庫后，將文庫進行擴增并測定其滴度，結(jié)果表明其滴度為6.0×106pfu/cm3，說明文庫具有較高的庫容，可用于后續(xù)篩選。

2.5 MTB基因組DNA文庫具有較好的重組率與隨機性 以隨機挑取的16個噬菌斑為模板，用PCR鑒定文庫的重組率與隨機性。如圖4所示，隨機挑取的16個噬菌斑PCR擴增全部成功，說明文庫具有很高的重組率；從圖可知，插入到噬菌體的外源DNA片段都介于250～2 000 bp范圍內(nèi)，具有較好的隨機性。其中7號和16號噬菌斑出現(xiàn)2條條帶，說明該序列中含有T7 Select引物的非特異結(jié)合位點。將PCR產(chǎn)物測序后進行Blast分析，結(jié)果顯示這些插入序列均源自MTB的基因組DNA。

M: DL5 000 DNA Marker; 1-16: PCR products.

圖4 MTB基因組DNA文庫隨機克隆的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products of random clones of MTB genomic DNA library

3 討 論

據(jù)估計，全球約有1/3的人口感染過MTB，其中5%～10%將發(fā)展成為活動性TB。耐藥菌株的出現(xiàn)與擴散、合并感染人類免疫缺陷病毒(HIV)、營養(yǎng)不良、經(jīng)常吸煙或罹患糖尿病等使免疫系統(tǒng)受損等因素使處于潛伏期的MTB活化或使部分個體繼發(fā)感染，導致TB的防治形勢越來越嚴峻[6-7]。控制和預防TB已成為全球的公共衛(wèi)生問題。目前，注射BCG是TB的唯一預防措施，由于BCG的免疫效果不穩(wěn)定，且只對預防原發(fā)性TB有效，對已感染MTB的患者無保護作用。研究人員一直在試圖研制一些新型、安全、有效的TB疫苗[8]，但至今沒有一種可真正用于臨床。因此，發(fā)展新型、安全、有效的TB疫苗，以有效控制TB的蔓延迫在眉睫。

如何確定MTB的哪些抗原是能夠刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應的優(yōu)勢抗原是研究TB疫苗最關鍵的問題。隨著分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展，涌現(xiàn)了很多用于病原體抗原篩選的方法，如噬菌體展示基因組DNA文庫技術、蛋白質(zhì)組學、表面分析技術和遺傳疫苗學等。這些方法中，由于展示在噬菌體表面的蛋白與天然蛋白相比結(jié)構與功能能保持相同或相似，因此基于噬菌體展示技術發(fā)展起來的噬菌體展示文庫技術在優(yōu)勢抗原或表位的篩選、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和配體-受體研究等領域具有巨大的優(yōu)越性[5]。如Zhao Y等對利用噬菌體展示文庫技術獲得了具有潛在臨床意義的自身免疫性疾病拮抗劑——B細胞刺激因子多肽[9]；Tang B等利用噬菌體展示肽庫技術篩選到腸道血管活性肽受體1的特異結(jié)合配體[10]。有研究人員利用噬菌體展示肽庫技術篩選到生殖支原體粘附素蛋白MgPa的抗原表位[11]和MgPa的受體多肽[12]。

最常用于噬菌體展示的載體有M13絲狀噬菌體和T7噬菌體，其中T7噬菌體在文庫構建方面具有明顯的優(yōu)越性：1)T7噬菌體可展示多達1 200個氨基酸的蛋白或多肽，而M13噬菌體僅能展示小于30個氨基酸的蛋白或多肽；2)T7噬菌體是裂解性噬菌體，其展示的蛋白不需分泌，因而能使更多的序列可能被展示；3)T7繁殖速度比M13快，更能節(jié)省時間；4)T7噬菌體活性強、穩(wěn)定性高。

本研究中，我們將MTB的基因組DNA片段克隆入T7Select10-3b載體，經(jīng)包裝后構建成T7噬菌體展示MTB基因組DNA文庫。經(jīng)檢測文庫滴度為6.0×106pfu/cm3；用PCR鑒定隨機挑取的噬菌斑，結(jié)果文庫的重組率達到100%，且插入片段都介于250～2 000 bp。這些結(jié)果表明：成功構建了T7噬菌體展示MTB的基因組DNA文庫。在下一步的研究中，將以純化的結(jié)核病人血清為靶分子，對構建的T7噬菌體展示MTB基因組DNA文庫進行親和篩選，以期從全基因組范圍內(nèi)獲得MTB的免疫優(yōu)勢抗原，并研究這些抗原在結(jié)核病的診斷制劑與疫苗研制中的應用價值，以豐富結(jié)核病的診斷與疫苗候選抗原。

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Construction and identification of T7 phage display genome DNA library ofMycobacteriumtuberculosis

ZENG Yan-hua1,WANG Li1,LIU Hai-can2,YOU Xiao-long1,DENG Xiang-ying1,WAN Kang-lin2

(1.InstituteofPathogenicBiology,UniversityofSouthChina,HunanProvincialKeyLaboratoryforSpecialPathogensPreventionandControl,Hengyang421001,China; 2.StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl/NationalInstituteforcommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

T7 phage displayed library of genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosiswas constructed to further screen the immunodominant antigens from the whole genome ofMycobacteriumtuberculosis. The total genomic DNA ofMycobacteriumtuberculosiswas extracted and digested withEcoRI andHindIII in order to fragment the genomic DNA and ligated withEcoRI /HindIII sticky ends. The DNA fragments that were longer than 200 bp were collected and ligated into the T7 10-3b phage vector. After packagedinvitro, the recombinant T7 phage vectors were transformed into BLT5403 to construct the T7 phage display library. The genomic DNA with high quality was successfully extracted. The titer of T7 phage display library was about 6×106pfu/cm3. The 16 phage plaques were randomly selected and amplified by PCR. The results of PCR showed that the recombination ratio was about 100%, and the inserts were long between 250 bp and 2 000 bp. And the results of BLAST analysis showed all sequences are originated fromMycobacteriumtuberculosis. These results indicated that the T7 phage display genome DNA library ofMycobacteriumtuberculosiswas successfully constructed, which lay the foundation for the screening of the immunodominant antigens from the whole genome ofMycobacteriumtuberculosis.

Mycobacteriumtuberculosis; genomic DNA; T7 phage display library

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.007

國家科技重大專項課題(No.2013ZX10003006-002)和湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心(湘教通2014-405號)聯(lián)合資助

萬康林，Email: wankanglin@icdc.cn

1.南華大學病原生物學研究所，“特殊病原體防控”湖南省重點實驗室，衡陽 421001； 2.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206

R378.91

A

1002-2694(2015)12-1120-04

2015-07-23；

2015-19-07