牛源大腸桿菌O157∶H7分離與鑒定及其毒力基因檢測

張 桃，蘇戰(zhàn)強，夏利寧，王雨朦，周銀萍，劉媛媛，買占海，張彩云，姚 剛，況 玲

牛源大腸桿菌O157∶H7分離與鑒定及其毒力基因檢測

張 桃，蘇戰(zhàn)強，夏利寧，王雨朦，周銀萍，劉媛媛，買占海，張彩云，姚 剛，況 玲

目的 研究新疆肉牛主產(chǎn)區(qū)健康牛群中該菌的攜帶情況及致病的可能性。方法 對采自新疆伊犁昭蘇縣某牛場健康牛的85份新鮮牛糞樣本，增菌后用SMAC平板和MUG實驗進行篩選，再用PCR技術(shù)和生化試驗鑒定；對分離到的E．coliO157∶H7用PCR法檢測其Stx1、Stx2、eaeA、tccp和Hly等基因攜帶情況；用腹腔注射EC肉湯增菌原液的方法進行動物攻毒實驗，確定分離菌株的致病性。結(jié)果 85份糞樣中只鑒定出1株E．coliO157∶H7，檢出率為1.176%；而這株菌同時攜帶被檢測的5種毒力基因；攻毒實驗所有的小白鼠于24 h內(nèi)全部死亡。結(jié)論 新疆伊犁地區(qū)牛群攜帶有E．coliO157∶H7，從所分離到菌株所攜帶的毒力基因情況和對小白鼠攻毒實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這株菌對人有很強的潛在致病性。

牛源大腸桿菌；E.coliO157∶H7；分離鑒定；毒力基因；動物毒性試驗

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageE．coli，EHEC) O157∶H7是一種致病力很強的，嚴(yán)重危害人類生命安全的食源性病原微生物[1]。被該菌感染后能引起人和動物的出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征(Hemolyticuremicsyndrome, HUS) 和血栓形成性血小板減少性紫癜(Thromboticthrombocytopenicpurpura, TTP)而致較高的死亡率，已在全球范圍內(nèi)引起關(guān)注[2]。1982年歐美首次報告該病暴發(fā)流行后[3]，世界各地不斷出現(xiàn)人感染E．coliO157∶H7病例的報道，有的是因為食用了被污染的肉制品[4]和奶制品[5-6]，有的則是因為食用了被污染的蔬菜。雖然許多動物都是E．coliO157∶H7的儲存宿主[7-8]，但是許多研究者都從牛糞便中分離到了該菌，并證明了其與食源性疾病的相關(guān)性，認(rèn)為牛是該病的主要傳染源[9]。攜帶E．coliO157∶H7的牛在排菌的同時可能沒有任何可見的臨床癥狀[10]，而由它們生產(chǎn)的牛肉或牛乳產(chǎn)品就可能被污染，其污染源主要是牛糞[11]，事實也證明人類食用被牛糞中E．coliO157∶H7污染了的牛肉是該病的主要發(fā)病原因之一[12]。因此許多研究者都致力于如何減少或消除牛體攜帶和排出E．coliO157∶H7的技術(shù)研究。

本實驗研究對新疆牛源E．coliO157∶H7進行特異性基因及毒力基因的檢測，調(diào)查新疆牛源大腸桿菌的流行現(xiàn)狀及毒力因子的攜帶情況，為新疆牛源E．coliO157∶H7污染狀況評估和源頭防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 樣品來源 采樣時間,2014年7月1日。采樣地點，新疆伊犁昭蘇縣某牛場。采樣方法，用一次性無菌塑料手套從健康牛排出的新鮮糞便中央進行采集，根據(jù)圈舍分組后進行編號，共85份。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 出血性大腸埃希氏菌(EscherichiacoliEHEC O157∶H7 )標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，菌號：CICC 21530；非EHEC O157∶H7大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，菌號：CICC 10389；兩株菌均購自中國工業(yè)微生物菌株保藏中心。

1.3 主要試劑與儀器 EC肉湯、山梨醇麥康凱培養(yǎng)基(SMAC)(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、DNA marker DL2000、2xTaq PCR Green Mix、DNA提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)、4-甲基傘形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15e(杭州天和微生物試劑有限公司)、生理鹽水(氯化鈉0.9 g、蒸餾水100 mL，高壓備用)；

空氣浴振蕩培養(yǎng)箱(型號MODEL：ST-F160AC)、TPro fessional 高性能梯度PCR儀(Biometra)、DYY-6C 型電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)：TransilluminatorGULABO。

1.4 引物選擇與合成 根據(jù)GenBank及參考相關(guān)文獻選取和設(shè)計E．coliO157∶H7 rfbE、fliC、志賀樣毒素1(Stx1)、志賀樣毒素2(Stx2)、緊密黏附素基因(eaeA)和內(nèi)膜素受體偶聯(lián)細(xì)胞骨架蛋白(tccp)、溶血素基因(Hly)、16S rRNA。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴增引物序列和反應(yīng)運行參數(shù)等見表1。

表1 PCR擴增引物序列和反應(yīng)運行參數(shù)

Note: F：上游；R：下游 F: Forward; R: Reverse

1.5 實驗動物 昆明白鼠(20±2)g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SCXK(新)2015-0001。

1.6 方法

1.6.1 增菌和SMAC平板培養(yǎng) 在無菌環(huán)境下稱取2 g糞樣加到10 mL的EC肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)18～24 h。然后劃線接種SMAC平板，培養(yǎng)18～24 h。

1.6.2 MUG實驗 挑選SMAC平板上生長的5～10個典型或可疑的灰白色菌落，接種MUG培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)后的MUG培養(yǎng)基在暗處用波長為365 nm功率為6 W的紫外光燈照射觀察，保存MUG試驗不發(fā)熒光的菌株，并進行進一步PCR和生化鑒定。

1.6.3 PCR擴增及同源性比較

1.6.3.1 細(xì)菌DNA模板的制備 在SMAC平板上挑取單個菌落至60 μL TE buffer中，用移液槍反復(fù)吹打混勻， PCR 儀中95 ℃ 5 min加熱，制成 PCR體系的基因組DNA。

1.6.3.2 rfbE、fliC及16S rRNA的檢測及序列測定PCR反應(yīng)體系 各反應(yīng)體系總量均為25 μL，其中Taq聚合酶預(yù)混染料(2× Taq PCR Green Mix)12.5 μL；F-Primer 1 μL；R-Primer 1 μL；細(xì)菌 DNA 模板1 μL；無菌水加至25 μL。按照表1中的運行參數(shù)進行擴增，反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL擴增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TAE，120 V恒壓電泳30 min，在EB 中浸泡 15 min 后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。將16S rRNA擴增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司進行序列測定，將測定結(jié)果登錄GenBank進行Blast，進行同源性比對。

1.6.4 生化鑒定 對rfbE、fliC同時陽性的菌株接種于 EC肉湯活化，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，接種于SMAC平板，37 ℃培養(yǎng)12 h，在無菌環(huán)境下挑取單個菌落分別接種于腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管中，同時以CICC 21530質(zhì)控菌株做對照，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24～48 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.6.5E．coliO157∶H7毒力因子的PCR檢測 各毒力基因的PCR反應(yīng)體系同1.6.3.2，PCR 反應(yīng)運行參數(shù)見表 1。反應(yīng)結(jié)束后，操作同1.6.3.2。

1.6.6 動物致病性實驗

1.6.6.1 菌液的制備 挑取4 ℃斜面保存的E．coliO157∶H7菌株在EC肉湯培養(yǎng)液中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h后，隨后接種SMAC平板，37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取單個圓形、光滑的灰白色菌落于EC肉湯中37 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，測定OD600，將OD值固定在1。

1.6.6.2 動物攻毒試驗 取20只體重為(20±2)g的昆明小鼠(雌雄各半)分為兩組，禁食不禁水12 h后，按0.5 mL/只的劑量腹腔注射，對照組小鼠注射同劑量滅菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)，觀察小白鼠的臨床癥狀。對死亡小鼠進行剖檢，觀察病變并采集小鼠脾臟和肝臟直接涂片鏡檢，對無菌采取的脾臟、肝臟的培養(yǎng)物進行病原分離[19]。

2 結(jié) 果

2.1 MUG實驗結(jié)果 SMAC平板篩選出的疑似E．coliO157∶H7菌株進行MUG 試驗后總計11株細(xì)菌不產(chǎn)生藍(lán)白色熒光。

2.2 rfbE、fliC、16S rRNA擴增結(jié)果及序列比對 結(jié)果以CICC 21530菌株、CICC 10389菌株作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控，對11株MUG實驗疑似陽性菌株進行PCR特異性擴增。經(jīng)rfbE基因PCR 特異性擴增后，1 株細(xì)菌可在500 bp出現(xiàn)典型單一條帶(圖1)；該菌株進行fliC基因擴增后可在625 bp出現(xiàn)單一目的DNA條帶(圖2)；又經(jīng)16S rRNA擴增后在1 439 bp出現(xiàn)單一條帶，命名該菌株為E.ZS-1。

將16S rRNA PCR產(chǎn)物進行測序，對其序列進行Blast分析，結(jié)果顯示，本試驗分離的菌株與EscherichiacoliO157∶H7 str. SS52的同源性為98%，該序列GenBank登錄號為CP010304.1。

M:DL2 000 marker;1: Negative control; 2: Positive control; 3: rfbE positive stripe.

圖1 rfbE擴增

Fig.1 PCR amplification of rfbE

2.3 生化實驗結(jié)果 E.ZS-1菌株的生化試驗結(jié)果符合GBT 4789.36-2008標(biāo)準(zhǔn)所列大腸埃希菌O157∶H7/NM的特征，結(jié)合PCR 試驗rfbE、fliC的擴增結(jié)果，確認(rèn)所分離的E.ZS-1是一株E．coliO157∶H7。生化結(jié)果見表2和圖3。

2.4E．coliO157∶H7毒力基因擴增結(jié)果 對E.ZS-1E．coliO157∶H7菌株進行毒力因子的檢測，結(jié)果顯示：Stxl基因(130 bp)、Stx2基因(346 bp)、eaeA基因(375 bp)、tccp基因(1 000 bp)、Hly基因(319 bp)均可擴增出特異性目的片段(圖4)。

M:DL2 000 marker;1: fliC positive stripe;2:Positive control; 3: Negative control.

圖2 fliC擴增

Fig.2 PCR amplification of fliC

M:DL2 000 marker;1: 16S rRNA positive stripe; 2:Positive control; 3: Negative control.

圖3 16S rRNA PCR擴增

Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA

表2 生化鑒定結(jié)果

Note: +：表示陽性結(jié)果；-：表示陰性結(jié)果;+ indicates positive result; -indicates negative result.

圖4 分離菌的生化鑒定結(jié)果圖

2.5 分離菌株E.ZS-1的致病性試驗結(jié)果

2.5.1 臨床癥狀及剖檢變化將E.ZS-1菌株原液注射昆明小鼠，試驗組小鼠經(jīng)腹腔注射菌液后均表現(xiàn)出了明顯的臨床癥狀，主要有精神沉郁、弓背、被毛松亂、昏睡等癥狀，小鼠在8～24 h全部死亡；空白對照組無異常。剖檢小鼠可見：實驗組小鼠胸腔、腹腔有大量出血、小腸出血、肝臟淤血(圖5)；空白對照組無變化(圖6)。

M: DL2 000 marker; 1:Stxlpositive stripe (130 bp); 2:Stx2 positive stripe (346 bp); 3:eaeApositive stripe (375 bp); 4:tccppositive stripe (1 000 bp); 5:Hlypositive stripe (319 bp)

圖5E．coliO157∶H7毒力基因擴增

Fig.5 PCR amplification ofE.coliO157∶H7virulence gene

3 討 論

調(diào)查牛群E．coliO157∶H7的感染情況，是控制其感染人繼而引發(fā)該病流行的關(guān)鍵措施。本研究從新疆伊犁某牛場采集的85份新鮮糞樣中只分離鑒定到一株E．coliO157∶H7，檢出率僅為1.18%。而趙璐[20]等從新疆4個地區(qū)不同牛場的208份糞便樣品中共檢出5株E．coliO157∶H7，檢出率為2.40%。戴賢君[21]等從浙江某屠宰場的采集240個豬肉樣本進行E．coliO157∶H7的檢測，結(jié)果分離到3株陽性菌株，檢出率為1.25%。趙秋華[22]等從上海地區(qū)不同豬場的280份樣品分離得到2株E．coliO157∶H7，檢出率為0.71%?？梢娫谖覈还苁桥Ｔ吹倪€是豬源的E．coliO157∶H7的檢出率都不是很高。

圖6 實驗組小鼠剖檢圖

圖7 對照組小鼠剖檢圖

從牛糞便中分離鑒定E．coliO157∶H7的方法有許多，但目前最常用的方法是用PCR的方法對經(jīng)選擇性培養(yǎng)基初篩選的菌株進行鑒定，一般檢測菌體是否有菌體O抗原基因(rfbEO157)和鞭毛H抗原基因(fliCH7)即可[23]。本試驗采用SMAC平板和MUG實驗進行初步篩選，再用PCR檢測rfbE和fliC基因，最后用生化試驗進行驗證。這種方法的優(yōu)點是在保證準(zhǔn)確率的前提下減少了工作量。缺點則是因為未使用免疫磁珠富集技術(shù)，檢出率可能相對較低，同時不能檢出那些不發(fā)酵山梨醇的E．coliO157∶H7。

E．coliO157∶H7致病力主要取決于其所能產(chǎn)生的毒力因子。E．coliO157∶H7毒力因子主要有志賀毒素(Shiga toxin，Stx)、溶血素(Haemolysin, Hly)和黏附與脫落(attach-ment and effacement ，A/E)損傷因子等。編碼這些因子的毒力基因主要有Stx1、Stx2、Hly和腸細(xì)胞脫落位點(Locus of Enterocyte Effacement， LEE)[24]等。LEE 毒力島區(qū)域含有編碼 A/E 損傷的所有基因以及編碼其它的一些毒力基因[25]，主要包括3個功能區(qū)：第1個區(qū)是編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)的基因，第2個區(qū)由eaeA與tir組成，第3個區(qū)則包括espD，espB和espA等[26]。本次分離到的這株E．coliO157∶H7同時攜帶所有被檢測的5種毒力基因，與我國其他地方分離到的一些菌株，具有明顯的區(qū)別。戴賢君[21]分離的3株豬源E．coliO157∶H7中，有2株同時含有SLT1、SLT2和eaeA3種毒力基因，而另外1株僅含有eaeA毒力基因。趙秋華[22]分離的2株豬源E．coliO157∶H7中1株含有Stx1和eaeA基因，而另1株僅檢測出eaeA基因。韋小瑜[27]等從貴州省1例腹瀉病例的糞便標(biāo)本中分離鑒定O157腸出血性大腸桿菌并對其進行毒力基因檢測，基因eaeA、Stx2和hly均陽性，而Stx1陰性。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為包含Stx2和eaeA的細(xì)菌致病力較強，但其對某個動物的致病性則是多因子綜合作用的結(jié)果。小鼠經(jīng)腹腔注射菌液后均表現(xiàn)出了明顯的臨床癥狀，小鼠在8 h開始死亡，24 h時全部死亡，說明該分離株有高致病性。

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Isolation and identification ofE.coliO157∶H7 strain from cattle and detection of its virulence genes

ZHANG Tao,SU Zhan-qiang,XIA Li-ning,WANG Yu-meng,ZHOU Yin-ping, LIU Yuan-yuan,MAI Zhan-hai,ZHANG Cai-yun,YAO Gang,KUANG Ling

(CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

To study theE.coliO157∶H7 carrying status of healthy cattle and the possibilities of the bacteria cause illness of human beings, 85 freshly collected healthy cattle fecal samples were screened with SMAC plate and MUG test after enrichment, and then PCR and biochemical tests were used to identify those SMAC and MUG negative strains. In order to determine the virulence of isolatedE.coliO157: H7,Stx1,Stx2,eaeA,tccpandHlywere detected by PCR, and mice were challenged by intraperitoneal injection of the bacteria. Result showed that only one strain ofE.coliO157: H7 was isolated and identified among 85 fecal samples; the isolate rate was 1.176%; and the isolate carried all five virulence genes which has been detected before; all challenged mouse died within 24 hrs.In conclusion,E.coliO157∶H7 strains are existed in cattle of Yili Prefecture in Xinjiang, considering the reality that the isolated strain carrying all five virulence genes and the capability of killing the mouse, there is a potential threatening to those people who consume cattle productions.

cattle;E.coliO157∶H7; isolation and identification; virulence genes; animal toxicity test

s: Kuang Ling, Email:Kuangling62@126.com; Yao Gang, Email: yaogang516@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.010

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(No.2014211A028)

況玲,Email：Kuangling62@126.com 姚剛,Email: yaogang516@163.com

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052

R378.2

A

1002-2694(2015)12-1136-06

2015-06-05；

2015-09-03

Supported by the Natural Science Foundation of the Xinjiang Uygur Autonomonus Region(No.2014211A028)