“小綠萼”梅離體快繁體系的建立

楊麗青+楊潔+毛慶山+包滿珠+張俊衛(wèi)

摘要：以梅花品種小綠萼1年生枝條為試驗(yàn)材料，研究了采樣時(shí)間、初代培養(yǎng)基、基本培養(yǎng)基和激素組合等對(duì)帶芽莖段離體繁殖的影響。結(jié)果表明：（1）最佳采樣時(shí)間為4—6月;（2）最佳腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L 6-BA+05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA;（3）最佳增殖培養(yǎng)基QL+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，增殖系數(shù)為427;（4）無(wú)菌苗在200 mg/L IBA浸漬處理數(shù)秒后，移植到1/2 QL培養(yǎng)基中，生根率為80%。

關(guān)鍵詞：梅花;離體快繁;莖段;培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào)： S685.170.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0062-03

收稿日期：2014-05-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31070624）;國(guó)家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2011AA100207）。

作者簡(jiǎn)介：楊麗青（1986—），女，山西朔州人，碩士，從事園林植物遺傳育種研究。E-mail：1270063665@qq.com。

通信作者：張俊衛(wèi)，博士，副教授，從事園林植物遺傳育種研究。E-mail：zjw@mail.hzau.edu.cn。

梅是原產(chǎn)中國(guó)的傳統(tǒng)名花，有悠久的栽培歷史和豐富的栽培品種，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在生產(chǎn)上，梅花以扦插、嫁接等無(wú)性繁殖為主，雖然能保持品種的優(yōu)良性狀，但是繁殖系數(shù)小，周期長(zhǎng)。利用組培快繁技術(shù)，不僅可在短期內(nèi)快速大量繁殖基因型一致的優(yōu)質(zhì)苗木，而且可獲得無(wú)病毒苗木，大大加快了育苗進(jìn)程和提高了苗木質(zhì)量。自Harada等[1]開(kāi)展梅莖段離體繁殖以來(lái)，國(guó)內(nèi)外在梅的離體快繁上取得了較快的進(jìn)展[2-5]，但目前仍存在建立快繁體系的梅花品種少，部分品種在快繁過(guò)程中出現(xiàn)頂芽壞死、葉片黃化等難題。小綠萼是武漢地區(qū)的梅花老品種，具有極高的觀賞價(jià)值。本研究旨在分析莖段采集時(shí)間、啟動(dòng)和增殖培養(yǎng)基對(duì)小綠萼離體繁殖的影響，以期建立其快繁體系，為該品種的應(yīng)用推廣提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料采于武漢市磨山中國(guó)梅花研究中心，除8—9月份停止采樣，分別在3—11月中旬采集梅花品種小綠萼（圖1-A）1年生枝條，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌及初代培養(yǎng) 采集回來(lái)的枝條剪成1～2 cm長(zhǎng)的具節(jié)莖段，每莖段1～2個(gè)腋芽。用洗潔精浸泡 10～20 min，流水沖洗30 min后在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸潤(rùn)30 s，轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2中消毒8～15 min，然后用無(wú)菌水沖洗6～7次，無(wú)菌濾紙拭干后接種于初代培養(yǎng)基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）;為分析不同初代培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響，以4月中旬采集的小綠萼枝條為材料，滅菌后接種至2種不同初代培養(yǎng)基：1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT。每處理20個(gè)外植體，重復(fù)3次，接種30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，污染率在接種后10～15 d內(nèi)統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 腋芽增殖培養(yǎng) 將伸長(zhǎng)到1～2 cm的腋芽切下，分別轉(zhuǎn)入添加了1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA的3種基本培養(yǎng)基和添加不同濃度6-BA和NAA組合的QL培養(yǎng)基中，觀察腋芽的增殖，每處理10個(gè)外植體，重復(fù)3次，記錄植株高度，生長(zhǎng)情況，接種5周后統(tǒng)計(jì)腋芽增殖情況。

1.2.3 叢生長(zhǎng)度對(duì)繼代的影響 待腋芽增殖形成的叢生芽伸長(zhǎng)到不同長(zhǎng)度（0.1、0.5～1、1～2 cm）時(shí)，將其從基部切下，放入繼代培養(yǎng)基（1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L KT）中觀察其生長(zhǎng)，每處理5個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.4 生根與移栽 選擇生長(zhǎng)健壯，株高超過(guò)2 cm的試管苗在5種生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。移栽時(shí)先將生根苗連培養(yǎng)瓶一起置于溫室內(nèi)進(jìn)行為期10 d的煉苗，在此期間逐漸松開(kāi)并揭去培養(yǎng)瓶的蓋子，而后將植株根系上的培養(yǎng)基洗凈，移栽到含有泥炭 ∶ 蛭石=1 ∶ 1 （體積比）的塑料盆中。移栽后的第1周塑料盆上覆蓋塑料薄膜以保濕，1周后慢慢揭去。

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度為（23±2） ℃，空氣相對(duì)濕度為60%左右，光照度為1 500～2 000 lx，光照周期為14 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣時(shí)間對(duì)腋芽誘導(dǎo)率的影響

莖段接種1周后腋芽開(kāi)始萌發(fā)，2周后腋芽開(kāi)始伸長(zhǎng)，葉片逐漸展開(kāi)，葉色濃綠（圖1-B）。不同時(shí)間采集的枝條在初代培養(yǎng)時(shí)，污染率和腋芽誘導(dǎo)率差異顯著 （表1），4月至6月中旬是最佳采樣時(shí)期，既可以保證較高的腋芽誘導(dǎo)率，而且污染率相對(duì)較低，其他時(shí)期采集的枝條污染率高，腋芽誘導(dǎo)率低，不適宜用作離體培養(yǎng)的外植體。

2.2 初代培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

4月采集的小綠萼枝條，接種于2種不同初代培養(yǎng)基中（表2），培養(yǎng)于添加KT的初代培養(yǎng)基中的外植體， 不僅腋芽誘導(dǎo)率高，而且芽伸長(zhǎng)快，葉色濃綠，無(wú)頂芽死亡、黃化問(wèn)題。

這與朱軍等的結(jié)果[6]相一致，即KT對(duì)長(zhǎng)蕊綠萼腋芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

2.3 基本培養(yǎng)基對(duì)腋芽增殖的影響

將伸長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到1～2 cm的腋芽接種到添加了1.0 mg/L BA和0.1 mg/L NAA的3種基本培養(yǎng)基（表3）中，芽的增殖和伸長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異（表4），QL上培養(yǎng)的腋芽出芽數(shù)顯著高于改良N6和1/2MS，伸長(zhǎng)長(zhǎng)度顯著高于改良N6。比較3種培養(yǎng)基上腋芽的生長(zhǎng)狀態(tài)以及出芽數(shù)和叢生芽平均高度，在增殖培養(yǎng)中采用QL作為基本培養(yǎng)基。

2.4 激素組合對(duì)增殖的影響

將伸長(zhǎng)長(zhǎng)度達(dá)到1～2 cm，且長(zhǎng)勢(shì)一致的的腋芽轉(zhuǎn)入添加不同6-BA和NAA濃度組合的QL培養(yǎng)中基中（表5），在6-BA濃度為0.2 mg/L時(shí)，叢生芽平均高度隨著NAA濃度的升高而下降，但沒(méi)有達(dá)到顯著差異，而增殖系數(shù)基本沒(méi)有變化，表明低濃度6-BA不能誘導(dǎo)腋芽增殖;當(dāng)6-BA濃度為 1.0 mg/L 時(shí)，叢生芽平均高度和增殖系數(shù)，隨著NAA濃度的升高先上升后下降，但叢生芽平均高度的變化沒(méi)有達(dá)到顯著水平，而增殖系數(shù)達(dá)到顯著差異;而當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，植株平均高度和增殖系數(shù)， 隨著NAA濃度的升高先下降

表1 采樣時(shí)間對(duì)小綠萼腋芽誘導(dǎo)的影響

取樣時(shí)間 3月 4月 5月 6月 7月 10月 11月

誘導(dǎo)率（%） 16.70±0.15c 75.00±0.16b 80.00±0.06ab 95.00±0.00a 0.00±0.00c 3.70±0.06c 14.70±0.13c

污染率（%） 83.00±0.15a 10.00±0.08b 19.70±0.06b 19.60±0.06b 100.00±0.00a 96.30±0.06a 85.00±0.13a

注：同行不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

表2 初代培養(yǎng)基對(duì)小綠萼腋芽誘導(dǎo)的影響

編號(hào) 培養(yǎng)基 萌芽率（%）

1 1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 66.70±0.08a

2

1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA 78.30±0.10a

注：同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05%水平上存在顯著差異。

表3 基本培養(yǎng)基對(duì)小綠萼腋芽增殖的影響

基本

培養(yǎng)基 平均芽個(gè)數(shù)

（個(gè)） 叢生芽平均

高度（cm） 生長(zhǎng)狀態(tài)

改良N6

1.17±0.29b

0.63±0.12b

葉嫩綠，簇生在基部，莖極度短縮

1/2MS 1.50±0.50b 1.20±0.08a 葉黃綠，愈傷團(tuán)褐化

QL 3.16±0.77a 1.38±0.43a 葉嫩綠，平展，生長(zhǎng)勢(shì)很強(qiáng)

注：同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

后上升，且變化值均達(dá)到顯著差異。最終選用QL+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA作為小綠萼增殖培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上叢生芽的數(shù)量多，且生長(zhǎng)正常（圖1-C）。

2.5 叢生芽長(zhǎng)度對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

將腋芽增殖培養(yǎng)后不同伸長(zhǎng)長(zhǎng)度的叢生芽，從基部切離后接種于繼代培養(yǎng)基，生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著差異（表3），長(zhǎng)度為1～2 cm的腋芽伸長(zhǎng)長(zhǎng)度最大，生長(zhǎng)健壯，葉片平展;而長(zhǎng)度為0.1～1 cm的腋芽生長(zhǎng)瘦弱，葉片黃化脫落，最后死亡。

2.6 試管苗的生根培養(yǎng)和移栽

切取高度2～3 cm的試管苗，轉(zhuǎn)入不同生根培養(yǎng)基（表6）中生根，培養(yǎng)30～40 d后形成根系（圖1-D、圖1-E）。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度對(duì)試管苗生根有顯著影響，只

表4 BA和NAA組合對(duì)腋芽增殖的影響

編號(hào) 6-BA濃度

（mg/L） NAA濃度

（mg/L） 叢生芽平均長(zhǎng)度

（cm） 增殖系數(shù)

1 0.2 0.05 0.96±0.27cd 1.00±0.00d

2 0.2 0.1 0.85±0.10de 1.04±0.00d

3 0.2 0.2 0.63±0.08d 1.00±0.00d

4 0.5 0.05 2.02±0.25a 4.27±0.64a

5 0.5 0.1 0.95±0.05d 1.13±0.06d

6 0.5 0.2 1.28±0.14cb 1.50±0.35c

7 1 0.05 1.26±011cb 1.00±0.00d

8 1 0.1 1.52±0.27b 1.90±0.50b

9 1 0.2 1.43±0.03b 1.00±0.00d

注：同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

表5 叢生芽長(zhǎng)度對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

編號(hào) 叢生芽長(zhǎng)度

（cm） 繼代培養(yǎng)后叢

生芽長(zhǎng)度（cm） 生長(zhǎng)狀況

1 0.1 0.44±0.12a 葉極度卷曲，生長(zhǎng)勢(shì)差

2

0.5～1

1.76±0.53b

葉嫩綠，平展，有輕微玻璃化，邊緣黃化

3 1～2 2.70± 0.56c 葉嫩綠，平展，生長(zhǎng)勢(shì)極好

注：同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上存在顯著差異。

添加了生長(zhǎng)素IBA的培養(yǎng)基生根率很低，僅為3.33%，且愈傷組織多。同時(shí)添加NAA和IBA的培養(yǎng)基以及添加IBA和活性炭的培養(yǎng)基，生根率、平均生根數(shù)和平均根長(zhǎng)顯著增加，但生根效果最佳的是試管苗先用200 mg/L IBA 浸漬，再培養(yǎng)于 1/2QL 培養(yǎng)基的處理，生根率達(dá)到最高（80%），與其他處理相比差異顯著，且平均根長(zhǎng)和根數(shù)也顯著增加。生根后的植株先在溫室煉苗10 d左右，然后移栽入塑料盆中（圖1-F），移

表6 生根培養(yǎng)基對(duì)小綠萼試管苗生根的影響

編號(hào) 生根培養(yǎng)基 生根數(shù)（條） 根長(zhǎng)（cm） 生根率（%）

1 1/2QL+0.2 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA 1.60 ±0.17b 5.88±2.42a 36.67±0.15b

2 1/2QL+0.5 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.84±1.46b 3.33±0.06c

3 1/2QL+0.05 mg/L IBA 0.33±0.58b 0.67±1.16b 3.33±0.06c

4 1/2QL+200 mg/L IBA 浸漬 3.81±1.78a 4.82±1.10a 80.00±0.10a

5 1/2QL+0.1 mg/L IBA+1 g/L活性炭 1.00±0.00b 3.29±1.14ab 36.67±0.06b

注：同列不同小寫(xiě)字母表示在0.05%水平上存在顯著差異。

栽存活率可達(dá)90%。

3 討論

3.1 外植體生理狀態(tài)對(duì)啟動(dòng)培養(yǎng)的影響

3月份梅花枝條上的葉芽開(kāi)始膨大，萌發(fā)抽生新枝，但此時(shí)的枝條過(guò)于幼嫩，容易受滅菌劑的影響而褐化死亡，同時(shí)污染率也較高，因此本試驗(yàn)中3月取樣的莖段萌芽率低;4—6月為梅新梢生長(zhǎng)旺盛期，本試驗(yàn)在此階段取樣的莖段萌芽率最高可達(dá)90%，且新葉嫩綠，生長(zhǎng)強(qiáng)健。這一結(jié)果與傅萼輝等、曲春苗等的研究相一致，即早春萌動(dòng)的腋芽是比較理想的離體培養(yǎng)外植體，因?yàn)榇藭r(shí)內(nèi)源IAA濃度較高[7-9]，有利于腋芽的萌發(fā)與生長(zhǎng)。但與Yonemitsu等的試驗(yàn)結(jié)果相反，他們認(rèn)為當(dāng)年11月到翌年2月在休眠枝上采集的冬芽，離體繁殖的成功率高，造成這種差異的具體原因尚需進(jìn)一步的分析[10]。

3.2 基本培養(yǎng)基對(duì)增殖培養(yǎng)的影響

在其他培養(yǎng)條件相同的情況下，果梅品種Nanko早春萌發(fā)的新芽，在WPM培養(yǎng)基上離體微繁時(shí)能增殖且生長(zhǎng)健壯，而在MS培養(yǎng)基上的芽會(huì)逐漸褐化死亡[1]。而呂英民等離體培養(yǎng)鐵骨紅1年生枝具節(jié)莖段時(shí)，通過(guò)比較外植體在6種基本培養(yǎng)基（QL、MS、WPM、M1、M2、M3）上腋芽增殖系數(shù)、平均伸長(zhǎng)長(zhǎng)度等指標(biāo)的差異，認(rèn)為QL是適合鐵骨紅生長(zhǎng)的最佳基本培養(yǎng)基[4，11]。本試驗(yàn)在小綠萼腋芽的增殖培養(yǎng)時(shí)，比較了改良N6、1/2MS和QL基本培養(yǎng)基對(duì)其增殖和生長(zhǎng)的影響，也發(fā)現(xiàn)QL基本培養(yǎng)基顯著優(yōu)于改良N6和1/2MS。

3.3 KT和BA對(duì)腋芽萌發(fā)和伸長(zhǎng)的影響

組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素有6-BA、KT和ZT，對(duì)梅花的增殖有不同的效果。從鐵骨紅試管苗增殖培養(yǎng)的結(jié)果看，6-BA和ZT優(yōu)于KT，而且增殖系數(shù)差異顯著。但增殖培養(yǎng)基中不添加IAA、IBA或NAA等生長(zhǎng)素，增殖芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)慢，影響試管苗正常生長(zhǎng)。細(xì)胞分裂素濃度過(guò)高，增殖芽數(shù)量雖然明顯增加，但多呈叢生狀，莖難以伸長(zhǎng)，且生長(zhǎng)細(xì)弱，葉小且葉色異常，甚至出現(xiàn)玻璃化苗[12]。為克服增殖苗生長(zhǎng)瘦弱，不得不采用壯苗培養(yǎng)基[7]。本試驗(yàn)在小綠萼腋芽增殖培養(yǎng)中所選用的3個(gè)6-BA濃度中，最適的濃度為0.5 mg/L，在添加此濃度6-BA的培養(yǎng)基中，不僅增殖系數(shù)最大，且叢生芽平均伸長(zhǎng)長(zhǎng)度也較大，當(dāng)6-BA濃度提高到1.0 mg/L，雖然產(chǎn)生了大量的叢生芽，但是繼代培養(yǎng)時(shí)叢生芽往往發(fā)生嚴(yán)重的褐化和黃化，漸漸死亡，同時(shí)玻璃化或畸形現(xiàn)象也逐漸加強(qiáng)，因此，在增殖培養(yǎng)中6-BA的濃度選定為0.5 mg/L。

3.4 浸漬法對(duì)生根培養(yǎng)的影響

在誘導(dǎo)梅試管苗生根時(shí)，既有單獨(dú)使用IBA或NAA的報(bào)道，也有同時(shí)使用IBA和NAA的報(bào)道[1，4，6，11]。Harada 等在研究生長(zhǎng)素對(duì)Nanko試管苗生根影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度的IBA（1～2 mg/L）或NAA（0.9～1.9 mg/L）容易使試管苗基部形成愈傷，本試驗(yàn)在生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L也易導(dǎo)致小綠萼試管苗形成大團(tuán)愈傷。呂英民等在進(jìn)行鐵骨紅試管苗生根培養(yǎng)時(shí)，觀察到生長(zhǎng)素種類(lèi)對(duì)生根影響顯著，其中NAA生根率較高，并且試管苗須根較多，但是根系比較細(xì)弱;添加IBA的試管苗根比較粗壯，但是根系較少;同時(shí)使用2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)不僅發(fā)根多，而且生長(zhǎng)粗壯。但在本試驗(yàn)中，IBA和NAA同時(shí)使用雖然生根數(shù)和生根率較單獨(dú)使用有所增加，但生根率偏低，而用200 mg/L IBA浸漬試管苗后培養(yǎng)于 1/2QL，其生根率可達(dá)80%，且平均生根數(shù)有顯著增加，此結(jié)果與新疆野生巴旦杏的生根試驗(yàn)相似[13]，其試管苗用 100 mg/L IBA浸漬處理60 min后轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，暗培2周后生根率可達(dá)100%。

參考文獻(xiàn)：

[1]Harada H，Murai Y. Micropropagation of Prunus mume[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，1996，46（3）：265-267.

[2]傅萼輝，徐惠珠，王豫蘭，等. ‘美人梅莖段離體培養(yǎng)[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，17（增刊1）：75-78.

[3]蔣澤平，梁珍海，朱 軍，等. 不同基因型梅花組織培養(yǎng)增殖率差異[J]. 北華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，6（6）：550-552.

[4]呂英民，曹 亮，張啟翔. 真梅系梅花品種“鐵骨紅”離體培養(yǎng)[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2007，34（4）：1047-1049.

[5]Ning G G，F(xiàn)an X L，Huang W J，et al. Micropropagation of six Prunus mume cultivars through axillary shoot proliferation，and ISSR analysis of cloned plants[J]. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica，2007，49（1）：25-31.

[6]朱 軍，郭立春.“長(zhǎng)蕊綠萼”梅花具節(jié)莖段組織培養(yǎng)初報(bào)[J]. 江蘇林業(yè)科技，2003，30（2）：16-17.

[7]傅萼輝，徐惠珠，王豫蘭，等. 梅花離體快速繁殖研究[J]. 武漢植物學(xué)研究，1991，9（3）：275-280，313.

[8]曲春苗，陳瑞丹，呂曉倩. 梅花雜交種莖段培養(yǎng)影響因素的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34（增刊1）：92-95.

[9]Murai Y，Harada H，Mochioka R，et al. Relationships between rooting in softwood cuttings of mume （Prunus mume Sieb. et Zucc.）and sorbitol in shoots[J]. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science，1999，68（3）：648-654.

[10]Yonemitsu H，Nishi K，Sagan S，et al.In vitro propagation of mature Japanese apricot（Prunus mume Sieb.et Zucc.）[J]. Horticultural Research，2003，2：77-82.

[11]呂英民，曹 亮，張啟翔. 不同種系梅花品種組織培養(yǎng)繁殖研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：74-79.

[12]朱 軍，張宇實(shí)，郭立春，等. ZT、IAA 對(duì)梅花試管苗增殖與生長(zhǎng)的影響[J]. 江蘇林業(yè)科技，2004，31（2）：18-19.

[13]曾 斌，羅淑萍，李 疆. 新疆野生巴旦杏的組織培養(yǎng)和植株再生[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29（4）：27-31.