戊二醛癸甲溴銨溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果研究

徐秀榮，劉霞，黃迪海，秦春芝，盛曉丹，張從敬，秦卓明，2?

（1.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟(jì)南250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南250031）

戊二醛癸甲溴銨溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果研究

徐秀榮1，劉霞1，黃迪海1，秦春芝1，盛曉丹1，張從敬1，秦卓明1，2?

（1.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟(jì)南250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，濟(jì)南250031）

以大腸桿菌（E.Coli.）和金黃色葡萄球菌（S.A）為殺菌對象，按照常規(guī)消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)了戊二醛癸甲溴銨溶液（JM）的消毒效果，同時(shí)選擇國外同類產(chǎn)品（FG）作對照。結(jié)果表明：當(dāng)JM 1∶700稀釋時(shí)，其對E.Coli.的殺菌率為99.96%；而FG則降至93.00%。當(dāng)JM在1∶1000稀釋時(shí)，對S.A.的殺菌率為99.86%；而FG僅為82.04%。當(dāng)兩種消毒劑分別按1∶128稀釋時(shí)，JM對E.Coli.殺菌率達(dá)100%時(shí)僅需2 min，而FG則需要5 min才能達(dá)到同樣的效果。對S.A的殺滅試驗(yàn)則顯示出同樣的規(guī)律。新研制的戊二醛癸甲溴銨溶液殺菌效果明顯優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。

戊二醛癸甲溴銨溶液；消毒；殺菌率；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌

伴隨著生活水平的不斷提高，人們對于食品安全的關(guān)注度愈來愈高，已經(jīng)由傳統(tǒng)的數(shù)量需求轉(zhuǎn)向質(zhì)量提高，而規(guī)?；?、集約化的養(yǎng)殖是確保畜禽產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。良好的消毒措施不僅是保護(hù)畜禽健康免受疾病困擾的技術(shù)保障，而且是顯著降低環(huán)境病原微生物的關(guān)鍵。因此，規(guī)范的消毒措施已成為一種最有效、最便利的預(yù)防及控制疾病的手段。高效價(jià)優(yōu)的消毒劑已成為規(guī)模化養(yǎng)殖廠的首選。戊二醛癸甲溴銨溶液是我國近年來新推出的一種新型復(fù)方消毒劑，它不僅綜合了醛類消毒劑和季銨鹽的優(yōu)點(diǎn)，而且二者相互協(xié)同，具有雙重殺菌效果［1］。武守艷等［2］、伍清林［3］等對戊二醛季銨鹽復(fù)合制劑進(jìn)行了臨床應(yīng)用研究，但是，有關(guān)戊二醛癸甲溴銨溶液在實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)定量和定性殺菌試驗(yàn)等鮮有報(bào)道。為評價(jià)戊二醛癸甲溴銨溶液的消毒效果，本實(shí)驗(yàn)按照國家獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（試行）和消毒和滅菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究，并同時(shí)選擇了國外同類產(chǎn)品，以大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.A）作為殺菌對象，分別進(jìn)行了定量殺菌試驗(yàn)、定性殺菌試驗(yàn)等，進(jìn)而探討該消毒劑的殺菌效果，以期對臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌（CMCC44103）購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；金黃色葡萄球菌（CMCC26003）購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 藥品

1.2.1 戊二醛癸甲溴銨溶液 含戊二醛5%、癸甲溴銨5%，以下簡稱“JM”，由山東省健牧生物藥業(yè)有限公司研制。

1.2.2 濃縮型消毒劑 含季銨鹽12.5%、戊二醛6.25%，以下簡稱“FG”，由法國某藥廠生產(chǎn)。

1.3 試劑 吐溫-80、甘氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水，培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂、LB液體和肉湯培養(yǎng)基。

1.4 儀器 超凈化工作臺（LCT-IDC-A）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-420型）、立式壓力蒸汽滅菌器（YM50）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型）、電子天平（YP5102型）和電熱恒溫水浴鍋（XMTD-400型）。

2 方法

2.1 試驗(yàn)依據(jù) 按照國家獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（試行）［4］和消毒滅菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行（簡稱“規(guī)范”）。

2.2 試驗(yàn)菌種的制備及活菌計(jì)數(shù)

2.2.1 菌懸液的制備 取第三代大腸桿菌（E.Coli.）、金黃色葡萄球菌（S.A.）復(fù)蘇劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單菌落接種于合適的液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)24 h。

2.2.2 活菌計(jì)數(shù)和稀釋 采用10倍稀釋和平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，重復(fù)試驗(yàn)3次，用0.03 mol／L的PBS將菌懸液稀釋成含菌107CFU／mL的試驗(yàn)菌液。

2.3 中和劑篩選實(shí)驗(yàn) 參照規(guī)范和韓杰［6］方法，選用3%吐溫-80+1%甘氨酸為中和劑，選擇濃度適宜的戊二醛癸甲溴銨溶液（JM），以E.Coli.和S.A為受試菌，分別進(jìn)行中和試驗(yàn)。試驗(yàn)分為6組，A：消毒劑+菌懸液；B：（消毒劑+菌懸液）+中和劑；C：中和劑+菌懸液；D：（消毒劑+中和劑）+菌懸液；E：PBS+菌懸液；F：PBS+中和劑。結(jié)果判定，A不長菌或長菌數(shù)遠(yuǎn)少于B，B長菌數(shù)超過100 CFU／mL，C、D、E組間菌數(shù)相差不超過10%，F(xiàn)不長菌，則判定所選中和劑及其濃度適宜。

2.4 定量法

2.4.1 在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不同濃度消毒劑的殺菌試驗(yàn)

結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將2種消毒劑按不同的稀釋倍數(shù)（對E.Coli：1∶500～1000；對S.A：1∶800～1400）稀釋至滅菌的西林瓶中，吸取0.5 mL試驗(yàn)菌液分別加于不同濃度的4.5 mL消毒劑溶液內(nèi)，置20℃水浴中作用5 min，立即吸取上述菌液混合液1.0 mL，加入9.0 mL中和液混勻；同時(shí)以0.03 mol／L PBS液代替消毒液進(jìn)行上述各步驟，作為對照組；中和10 min后進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算殺菌率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做2個(gè)平行樣，用t檢驗(yàn)法分析差異顯著性。

2.4.2 消毒劑濃度和作用時(shí)間對殺菌效果的影響選擇1∶700、1∶800和1∶900三個(gè)濃度的消毒液分別對E.Coli.進(jìn)行殺菌；同時(shí)，選擇1∶900、1∶1000、1∶1200稀釋的三個(gè)濃度分別對S.A殺菌。將消毒劑稀釋至所需濃度，置西林瓶中，吸取4.5 mL加入試管中，20℃水浴，待試管內(nèi)液體溫度與水浴溫度平衡后，在試管中加入0.5 mL菌懸液，混均并開始計(jì)時(shí)，分別在5、10、30、60 min，各取0.5 mL菌液混合液移入4.5 mL中和劑混勻。中和10 min，取0.1 mL三者混合液采用平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)；以0.03 mol／L的PBS液代替消毒液同步重復(fù)上述步驟，作為對照組；計(jì)算殺菌率。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次做2個(gè)平行樣，用t檢驗(yàn)法分析差異顯著性。

2.5 定性法

2.5.1 消毒劑濃度選擇 將滅菌試管10支排列于試管架上，標(biāo)記管號。每個(gè)試管加滅菌水2.5 mL，放（20±2）℃水浴中。于第1管內(nèi)加適當(dāng)濃度消毒液2.5 mL，混勻后取2.5 mL移入第2管，依次混勻，從第2管中取2.5 mL移入第3管，以此類推至第9管，混勻后棄去2.5 mL，第10管中不加消毒液作對照。

2.5.2 消毒劑與細(xì)菌作用 將菌液用稀釋液配制成含菌量為5×105～5×106CFU／mL的菌懸液。以每半分鐘加一管的速度加菌懸液2.5 mL于上述各管中，混勻并記錄各管加菌時(shí)間。各管分別于加菌后2、5、10、30 min四個(gè)不同間隔時(shí)間，取出0.5 mL，加入4.5 mL中和劑內(nèi)，中和10 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL營養(yǎng)肉湯管內(nèi)，37℃培養(yǎng)48 h，觀察初步結(jié)果，無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。

2.5.3 結(jié)果判定 若肉湯管混濁，則表示有菌生長，記為陽性，以（+）表示。若培養(yǎng)至第7天，肉湯管澄清，則表示無菌生長，記為陰性，以（-）表示。無指示菌生長表示達(dá)到滅菌。

3 結(jié)果

3.1 中和劑篩選結(jié)果 由表1可知，含3%吐溫-80+1%甘氨酸的溶液符合作為戊二醛癸甲溴銨溶液中和劑的要求，且中和劑與中和產(chǎn)物對E.Coli和S.A無不良影響。三次試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

表1 中和劑篩選試驗(yàn)結(jié)果表

3.2 定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 在規(guī)定時(shí)間內(nèi)不同濃度消毒劑的殺菌試驗(yàn)對E.Coli的消毒效果表明：當(dāng)JM消毒劑在稀釋倍數(shù)為1∶500、1∶600、1∶700時(shí)，其對E.Coli的殺菌率均不低于99.95%，在1∶800時(shí)，殺菌效果仍為93.5%；而FG消毒劑在稀釋倍數(shù)1∶500、1∶600與JM相同，但在1∶700和1∶800的殺菌率僅為93.00%和61.35%，明顯低于JM的殺菌效果（表2）。

對S.A的殺菌效果表明：當(dāng)JM在稀釋倍數(shù)為1∶800、1∶900時(shí)對S.A的殺菌率均為100.0%，在1∶1000的殺菌率為99.86%；而消毒劑FG在1∶800的殺菌率僅為90.52%。消毒劑JM對S.A殺菌效果顯著，而消毒劑FG效果不佳（表3）。

表2 消毒劑500～1000倍稀釋與大腸桿菌作用5 min的殺菌效果表

表3 消毒劑800～1400倍稀釋與金黃色葡萄球菌作用5 min的殺菌效果表

3.2.2 消毒劑濃度和作用時(shí)間對殺菌效果的影響表4和5顯示的是消毒劑不同濃度和作用時(shí)間對E.Coli和S.A殺滅率的影響。由表4可知：JM在1∶700稀釋時(shí)對E.Coli完全殺滅的時(shí)間不超過5 min，而同等條件下FG至少需要30 min。而在1∶900稀釋時(shí)，JM對E.Coli完全殺滅的時(shí)間為30 min，而FG則需60 min。很明顯，在同等條件下，JM對E.Coli的殺滅時(shí)間要短，且需要的濃度低，差異顯著。對S.A的實(shí)驗(yàn)反映出同樣的規(guī)律（表5）。

表4 消毒劑固定濃度、不同殺菌時(shí)間對大腸桿菌的殺菌效果表

表5 消毒劑固定濃度、不同殺菌時(shí)間對金黃色葡萄球菌的殺菌效果表

3.3 定性殺菌試驗(yàn)

3.3.1 對大腸桿菌的定性殺菌作用 表6顯示的是消毒劑的稀釋濃度與E.Coli相互作用時(shí)間的相關(guān)性。由表6可知，消毒液濃度愈低（稀釋倍數(shù)大），作用時(shí)間愈長，反之，作用時(shí)間短。當(dāng)兩種消毒劑分別按1∶128、1∶64倍稀釋與E.Coli作用時(shí)，JM殺菌率達(dá)100%僅需2 min，而FG在1∶128稀釋時(shí)，則需要5 min才能達(dá)到100%的殺菌效果。很明顯，JM溶液的稀釋倍數(shù)更大，有明顯差異。進(jìn)行了三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果是一致的。

表6 消毒劑對大腸桿菌的定性殺菌結(jié)果表

3.3.2 消毒劑對金黃色葡萄球菌的定性殺菌作用表7顯示的是消毒劑的稀釋濃度與S.A相互作用時(shí)間的相關(guān)性，該結(jié)果與表6結(jié)論相同。

表7 消毒劑對金黃色葡萄球菌的定性殺菌結(jié)果表

4 討論

4.1 戊二醛是一種速效、廣譜的化學(xué)滅菌劑，在常溫下低濃度的戊二醛水溶液即可對多種微生物表現(xiàn)出殺滅活性，對繁殖型的細(xì)菌、病毒、分枝桿菌、致病性霉菌和細(xì)菌芽孢等均能殺滅，且對人毒性較低。癸甲溴銨復(fù)配性能好，不僅能與陽離子、非離子、兩性離子表面活性劑配伍，與乙醇、異丙醇等溶劑復(fù)配成復(fù)合制劑，耐溫、耐光，而且能殺滅細(xì)菌繁殖體、真菌、病毒（如馬立克氏病毒、新城疫病毒等）等［7］，屬高效消毒劑。戊二醛和癸甲溴銨均為速效、高效的消毒劑，但二者單獨(dú)使用時(shí)皆受到微生物的種類、使用濃度、環(huán)境中有機(jī)物等因素的干擾，而二者協(xié)同更易進(jìn)入細(xì)菌、病毒內(nèi)部，破壞蛋白質(zhì)和酶活性，達(dá)到快速高效的協(xié)同增效作用。此外，二者復(fù)合還可降低戊二醛的使用濃度，減少對粘膜的刺激性和對金屬的腐蝕性［8］。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別進(jìn)行了10%戊二醛溶液和JM（1∶800倍稀釋）兩種消毒劑對大腸桿菌的抑菌試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)JM的抑菌效果最佳，說明制成戊二醛、癸甲溴銨復(fù)方制劑后，產(chǎn)品抑菌效果可大大提高。

4.2 研究表明，兩種消毒劑產(chǎn)品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有良好的殺滅效果，但殺菌效果與消毒劑的濃度、作用時(shí)間等密切相關(guān)。其中，在相同的時(shí)間內(nèi)，JM對大腸桿菌殺滅的最佳濃度是1∶700，對金黃色葡萄球菌的濃度為1∶900，而同等條件下，F(xiàn)G對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅率僅為93.0%和88.05%，明顯低于JM的殺滅效果。在相同的濃度下，JM溶液在1∶128對大腸桿菌的最短殺滅時(shí)間為2 min，F(xiàn)G溶液至少5 min；對金黃色葡萄球菌顯示出類似的結(jié)果。因此，該試驗(yàn)證實(shí)：JM溶液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果比FG更佳。是否與配方中的癸甲溴銨和季銨鹽有存在差別有關(guān)？值得進(jìn)一步研究。

4.3 通常在試驗(yàn)條件下評價(jià)消毒劑的殺菌效果時(shí)，往往當(dāng)混合液移到培養(yǎng)基時(shí)，不可避免地帶有少量殘余消毒劑，可能會阻礙細(xì)菌在培養(yǎng)基中的進(jìn)一步生長繁殖，形成陰性結(jié)果［9］，所以，在定量殺菌濃度試驗(yàn)時(shí)，一般要除去殘余的消毒劑的影響。本試驗(yàn)利用含3%吐溫-80+1%甘氨酸的溶液符合作為戊二醛癸甲溴銨溶液的中和劑，獲得了較好的實(shí)驗(yàn)效果，該中和劑不僅能夠有效中和消毒劑，而且其濃度并不影響細(xì)菌的生長。

4.4 本次試驗(yàn)是對戊二醛癸甲溴銨溶液的初步研究。在實(shí)驗(yàn)室條件下證實(shí)，該復(fù)合溶液（JM）消毒效果不僅優(yōu)于其中任何一種單品溶液，還優(yōu)于進(jìn)口的戊二醛和季銨鹽（FG）溶液，且價(jià)格僅為進(jìn)口制劑的40%，因此，可大大降低消毒用藥成本，在臨床上具有較強(qiáng)的推廣價(jià)值。該消毒劑對結(jié)核桿菌、芽孢、霉菌和病毒等的消毒試驗(yàn)還在進(jìn)行中，以期為臨床消毒提供更加詳實(shí)的技術(shù)支持。

［1］ 邱梅，郝智慧，厐云露，等.國內(nèi)外獸用消毒劑的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢［J］.中國獸藥雜志，2011，45（6）：43-47.

［2］ 吳守艷，韓一超，張玉換，等.戊二醛癸甲溴銨消毒劑對幾株病原菌的殺滅效果研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（11）：70-71.

［3］ 伍清林，金蘭梅，張玉紅，等.豬舍環(huán)境中細(xì)菌總數(shù)測定和消毒劑對致病菌的敏感性試驗(yàn)［J］.金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28（4）：71-78.

［4］ 農(nóng)業(yè)部1992農(nóng)（牧藥）字第101號.獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（試行）［S］.

［5］ 袁洽劻，王太星，顧健.GB-15981-1995消毒與滅菌效果的評價(jià)方法與標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［6］ 韓杰，魏秋華.化學(xué)消毒劑的中和劑研究現(xiàn)狀［J］.中國消毒學(xué)雜志，2013，30（12）：1165-1168.

［7］ 楊鴻，劉記文，羅秋桃，等.新型季銨鹽復(fù)方消毒劑對微生物殺滅效果的實(shí)驗(yàn)觀察［J］.養(yǎng)禽與禽病防治，2010，（4）：12-14.

［8］ 徐文體.戊二醛殺菌作用及毒副反應(yīng)研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003，30（3）：399-400.

［9］ 張冰，秦秀慧，李軍，等.戊二醛和季銨鹽復(fù)合消毒劑對雞常見病原微生物殺滅效果的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志，2002，12（2）：95-98.

（編輯：侯向輝）

Effect Test of Disinfection Compound of Glutaral and Deciquam Solution on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

XU Xiu-rong1，LIU Xia1，HUANG Di-hai1，QIN Chun-zhi1，SHENG Xiao-dan1，ZHANG Cong-jing1，QIN Zhuo-ming1，2?
（1.Shandong JM Biological Pharmaceutical Co Ltd，Jinan 250100；2.Institute of Poultry Science，Shandong Academy of Agricultural Science，Jinan 250031，China）

The effects of the newly developed disinfection consisting of glutaral and deciquam solution（JM）were performed on by using Escherichia coli and Staphylococcus aureus as objects according to the testing standard of disinfectant routine，while selecting similar foreign products（FG）as a control.The results demonstrated that when the two disinfectants were diluted at 1∶700，JM’s disinfection rate against Escherichia coli was higher more than 99.96%as well as the FG was only 93.00%.When JM was diluted at 1∶1000，the sterilization rate was 99.86%against Staphylococcus aureus，while the FG was less than 82.04%.Furthermore，when the two kinds of disinfectants against Escherichia coli were diluted at 1∶128，the bactericidal rate by JM was owned by 100%in 2 min，whereas FG for 5min to achieve the same results.The above results confirmed that bactericidal effect of the newly developed glutaral and deciquam solution was significantly better than comparable foreign products，and had a price advantage，worthy of promotion.

glutaral and deciquam solution；disinfection；sterilization rate；Staphylococcus aureus；Escherichia coli

2015-01-07

A

1002-1280（2015）03-0030-05

S859.79

國家自然基金（31372332）、科技部農(nóng)轉(zhuǎn)資金（SQ2013ECC600059）和濟(jì)南市成果轉(zhuǎn)化支持項(xiàng)目（2012CG92）

徐秀榮，助理研究員，從事獸藥檢驗(yàn)分析及新獸藥的研發(fā)。

秦卓明。E-mail：qinzm1997＠163.com