蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)條件研究

王慶菊

（長(zhǎng)春漢高表面技術(shù)有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130012）

0 引 言

螺旋粉虱是全球的經(jīng)濟(jì)性作物害蟲（Lauofo［1］，1982），1965年在美國(guó)佛羅里達(dá)州被Russell首次報(bào)道并記述為新種，屬同翅目（Homoptera），粉虱科（Aleyrodidae）。螺旋粉虱具有寄主種類多、傳播方式多樣且繁殖速度快等特點(diǎn)，最初產(chǎn)于中、南美洲和加勒比海的新熱帶地區(qū)［2］，至今幾乎遍布整個(gè)熱帶地區(qū)。2006年海南首次報(bào)道螺旋粉虱，調(diào)查發(fā)現(xiàn)其在海南的寄主達(dá)到49科97屬115種（變種）［3］。

目前，防治螺旋粉虱主要使用化學(xué)農(nóng)藥，化學(xué)農(nóng)藥凸顯出諸多問(wèn)題，既傷害了天敵，又污染了環(huán)境，蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物中農(nóng)藥的殘留會(huì)影響人類的健康，故人們不斷探索新型藥劑以控制螺旋粉虱為害［4］。生物源農(nóng)藥就是其中一類，其對(duì)環(huán)境友好，人畜安全是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

蠟蚧輪枝菌（Verticillium lecanii）是蚜蟲、蚧類及粉虱等同翅目害蟲的重要病原真菌之一。普遍分布在溫帶、熱帶和亞熱帶，寄主范圍很廣，亦可寄生鱗翅目、等翅目、鞘翅目等昆蟲以及植物病原菌［5－7］。蠟蚧輪枝菌在歐洲有兩個(gè)品系已經(jīng)商品化，用于控制溫室蔬菜害蟲白粉虱（Mycotol）和蚜蟲（Vertalec）［8］。我國(guó)也有利用蠟蚧輪枝菌防治白粉虱、煙粉虱、溫室白粉虱等溫室害蟲的報(bào)道［9］，但是應(yīng)用蠟蚧輪枝菌防治螺旋粉虱及其螺旋粉虱感病后病理學(xué)變化在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。

目前，我國(guó)主要研究螺旋粉虱的生物學(xué)特性、種群動(dòng)態(tài)及化學(xué)防治等，如2010年，石艷華［10］等應(yīng)用石蠟切片技術(shù)分別研究螺旋粉虱成蟲復(fù)眼、雌雄觸角感器以及消化系統(tǒng)的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。在前人研究的基礎(chǔ)上，文中主要對(duì)蚧輪枝菌孢子萌發(fā)條件和感染螺旋粉虱后的組織病理學(xué)進(jìn)行研究，孢子萌發(fā)是成功侵染螺旋粉虱的先決條件，為成功開發(fā)生防菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源

從番石榴葉片上感病的螺旋粉虱蟲體上分離，采用單孢分離法分離純化，根據(jù)常規(guī)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)初步鑒定該菌株屬于蠟蚧輪枝菌（Verticillium lecanii.sp）。

1.1.2 供試?yán)ハx

從野外摘取帶有螺旋粉虱成蟲的番石榴葉片，將螺旋粉虱成蟲接種于番石榴苗上，48h后將番石榴苗移到養(yǎng)蟲室中，待螺旋粉虱若蟲長(zhǎng)至適合齡期時(shí)，供生物測(cè)定使用。

1.1.3 試劑配置

配 制100mL 10×PBS（pH值7.2）：137mmol／L NaCl；2.7mmol／L KCl；4.3mmol／L Na2HPO4·12H2O；1.4mmol／L KH2PO4；用DEPC處理水配制，pH調(diào)至7.2。

1.1.4 接種孢子懸浮液的制備

將復(fù)壯后的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，前3d黑暗培養(yǎng)有利于孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，后4d（L∶D＝14∶10）光照培養(yǎng)促進(jìn)分生孢子的形成。用含有0.1%吐溫－80的無(wú)菌水收集蠟蚧輪枝菌分生孢子，過(guò)濾后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法分別配置2×105，2×106，2×107，2×108，2×109個(gè)·mL－1的孢子懸浮液各50mL備用，另用含0.1%吐溫－80的無(wú)菌水作對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 分生孢子萌發(fā)條件研究

1.2.1.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

采用瓊脂玻片法測(cè)定，取培養(yǎng)10d的蠟蚧輪枝菌分生孢子，配制成2×107個(gè)·mL－1的孢子水懸浮液（含0.1%吐溫－80）。搖勻后取20μL涂布于含沙氏培養(yǎng)基的載玻片上，分別放置于設(shè)定為15，20，25，30，35℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，每4h觀察一次孢子萌發(fā)率，每個(gè)處理觀察的孢子數(shù)不少于300個(gè)，每個(gè)溫度設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.1.2 營(yíng)養(yǎng)對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

采用瓊脂玻片法測(cè)定，取培養(yǎng)10d的蠟蚧輪枝菌分生孢子，分別用無(wú)菌水、1%葡萄糖液、1%麥芽糖液、薩氏培養(yǎng)液和沙氏培養(yǎng)液配制2×107個(gè)·mL－1的孢子懸浮液（含0.1%吐溫－80）。搖勻后取20μL涂布于含水瓊脂載玻片上，30℃恒溫培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，每4h觀察一次孢子萌發(fā)率，每個(gè)處理觀察的孢子數(shù)不少于300個(gè)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.1.3 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

參照方仲達(dá)［11］的飽和鹽控制濕度法，不同飽和鹽控制的相對(duì)濕度見表1。

表1 不同飽和鹽控制的相對(duì)濕度表

配置2×107個(gè)·mL－1蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液（含0.1%吐溫－80），搖勻后取20μL涂布于含沙氏培養(yǎng)基的載玻片上，利用30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每個(gè)濕度分別設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每4h觀察一次孢子萌發(fā)率，每次觀察的孢子數(shù)不少于300個(gè)，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2 不同濃度孢子懸浮液對(duì)螺旋粉虱若蟲的侵染力

生物測(cè)定參照張仙紅［12］噴霧法，將系列梯度濃度的孢子懸浮液用猴頭噴霧器噴于3齡若蟲整齊的新鮮石榴葉片上，至葉片表面濕潤(rùn)，將葉片保濕后放入30℃恒溫氣候箱中。培養(yǎng)48h后，每隔24h檢查1次感病癥狀和侵染數(shù)量，直至第7天為止，每個(gè)處理300頭蟲，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，記錄螺旋粉虱蟲體長(zhǎng)出白色菌絲或表面有灰色顆粒狀的蟲數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分生孢子萌發(fā)條件結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響見表2。

表2 溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，在相同濕度和營(yíng)養(yǎng)的條件下，15～35℃之間孢子均能萌發(fā)，萌發(fā)率大小如下：30℃＞25℃＞20℃＞35℃＞15℃，且各溫度梯度差異顯著。在25～30℃之間，12h時(shí)孢子萌發(fā)率均達(dá)到了94%以上，孢子萌發(fā)速率快且整齊。綜上所述，適宜孢子萌發(fā)溫度為25～30℃，最適溫度為30℃。

2.1.2 營(yíng)養(yǎng)對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

不同營(yíng)養(yǎng)對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響見表3。

表3 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明，不同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)孢子萌發(fā)影響較大，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，孢子萌發(fā)率逐漸遞增。16h時(shí)，4種營(yíng)養(yǎng)液中沙氏培養(yǎng)基孢子萌發(fā)率最高達(dá)到99.63%，20h時(shí)，無(wú)菌水孢子萌發(fā)率達(dá)到70.63%，1%葡萄糖萌發(fā)率僅達(dá)到58.38%。因此，最適宜孢子萌發(fā)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為沙氏培養(yǎng)基，葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)有一定的抑制作用。

2.1.3 濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響見表4。

結(jié)果表明，在相同溫度和營(yíng)養(yǎng)條件下，相對(duì)濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響較大，孢子萌發(fā)率隨著濕度的下降而降低。飽和濕度下，16h孢子萌發(fā)率達(dá)到99.4%，而且孢子萌發(fā)快速且整齊。相對(duì)濕度在85%以上時(shí)，孢子萌發(fā)率均在85%以上；當(dāng)相對(duì)濕度為53%時(shí)，20h孢子萌發(fā)率僅為7.33%。隨著濕度的降低，延長(zhǎng)了孢子的萌發(fā)時(shí)間，降低了孢子萌發(fā)率。

表4 濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

2.2 不同濃度孢子懸浮液對(duì)螺旋粉虱若蟲的侵染力

蠟蚧輪枝菌對(duì)螺旋粉虱的致病力如圖1所示。

圖1 蠟蚧輪枝菌對(duì)螺旋粉虱的致病力

由圖1可以看出，接種5d后，2×109孢子·mL－1對(duì)螺旋粉虱3齡蟲致死率達(dá)到98.18%，其它4個(gè)濃度的孢子懸浮液致死率均在90%以下；7d時(shí)，除2×105孢子·mL－1的致病性低于70%以外，其它濃度的致病性均達(dá)到85%以上，其中2×109孢子·mL－1螺旋粉虱的死亡率達(dá)到99.39%。因此，不同濃度孢子懸浮液對(duì)螺旋粉虱的致病性隨著有效侵染時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

蠟蚧輪枝菌分生孢子的萌發(fā)率決定菌株的致病性，只有透徹研究孢子萌發(fā)條件才能提高該菌株侵染的機(jī)率［13－14］。蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)適宜溫度為25～30℃，與昆明菌株KM9803的適宜產(chǎn)孢溫度基本一致［15－16］，在適宜的溫度范圍內(nèi)孢子萌發(fā)快速而集中，為以后的實(shí)際應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。濕度是影響蠟蚧輪枝菌毒力的關(guān)鍵因子之一，直接影響孢子在昆蟲體表萌發(fā)和侵染時(shí)間，從而影響蠟蚧輪枝菌致病性。當(dāng)濕度逐漸增大時(shí)，孢子萌發(fā)率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著遞增。馮明光［17］等研究發(fā)現(xiàn)，將蠟蚧輪枝菌分生孢子在高濕條件下保存后轉(zhuǎn)移到70%濕度下保存，孢子萌發(fā)率顯著降低。綜上所述，高溫高濕有利于提高蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)率和致病性［18］。

蠟蚧輪枝菌分生孢子液對(duì)螺旋粉虱若蟲有很好的殺蟲效果，2×107～2×109孢子·mL－1有很好的速效性，2×105和2×106孢子·mL－1有很好的持效性，與蠟蚧輪枝菌對(duì)桃蚜的侵染力結(jié)果一致［19］。蠟蚧輪枝菌分生孢子濃度為3×107孢子·mL－1時(shí)，對(duì)溫室白粉虱的防治效果在58%～60%，對(duì)螺旋粉虱的防治效果可以達(dá)到69%～85%，該菌株防治螺旋粉虱的效果明顯高于對(duì)溫室白粉虱的防治效果［20］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蠟蚧輪枝菌可以侵染剛羽化的螺旋粉虱成蟲，說(shuō)明蠟蚧輪枝菌不僅對(duì)螺旋粉虱若蟲有致病性，對(duì)成蟲也有致病性，但是對(duì)成蟲的致病性沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)的研究，有待進(jìn)一步完善。

蠟蚧輪枝菌對(duì)寄主的易感性可能與寄主昆蟲表皮的結(jié)構(gòu)和成分有關(guān)。表皮的成分對(duì)蠟蚧輪枝菌的致病性有很大的影響，如幾丁質(zhì)、長(zhǎng)鏈脂肪酸、N－乙酰氨基酸葡萄糖、淀粉等可以促進(jìn)孢子的萌發(fā)，但是癸酸和辛酸等物質(zhì)可以抑制孢子的萌發(fā)。昆蟲不同的發(fā)育階段影響蠟蚧輪枝菌的致病性，隨著昆蟲蟲齡的不斷提高，表皮的骨化程度逐漸增強(qiáng)，蠟蚧輪枝菌的侵入速度也會(huì)逐漸減慢，從而降低了寄主昆蟲對(duì)蠟蚧輪枝菌的易感性［21－25］。

文中沒(méi)有研究紫外線對(duì)孢子萌發(fā)的影響，在田間使用時(shí)可能會(huì)影響對(duì)螺旋粉虱的防治效果，將在以后的試驗(yàn)中進(jìn)一步補(bǔ)充；蠟蚧輪枝菌對(duì)螺旋粉虱若蟲的致病性很高，對(duì)螺旋粉虱卵和蛹的致病性沒(méi)有做深入的研究，設(shè)計(jì)蠟蚧輪枝菌分生孢子侵染力的試驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有研究表面活性劑對(duì)致病性的增效作用，蠟蚧輪枝菌應(yīng)用時(shí)的施菌方式、施用時(shí)間、劑型及菌藥聯(lián)用的效果等均需進(jìn)一步研究。

［1］ 徐巖.警惕螺旋粉虱傳入中國(guó)［J］.植物檢疫，1999（4）：41－45.

［2］ Russell L M.A new species of aleurodicus douglas and two close relatives（Homoptera：Aleyrodidae）［J］.Fla Entmol.，1965，48：47－55.

［3］ 李國(guó)寅，艾怡雯，王偉，等.海南島螺旋粉虱寄主植物新記錄種調(diào)查［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2010（4）：655－660.

［4］ 王克勤，劉春來(lái)，于振民，等.蠟蚧輪枝菌防治溫室白粉虱應(yīng)用研究［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（5）：9－11.

［5］ Ghewande M P.Biological control of groundnut rust in India［J］.Tropical Pest Management，1990（1）：17－20.

［6］ HallR A.Control of aphids by the fungus，Verticillium lecanii：effeet of spore concentration［J］.Entomologica Experimentaet Applicata，1980（27）：1－5.

［7］ Williams M E D，Edmondson R N，Gill G.The potential of some adjuvants in promoting infection with verricillium lecanii：laboratory bioassays with myzus persicae［J］.Annals of Applied Biology，2000，137（3）：337－345.

［8］ 繆森.蠟蚧輪枝菌對(duì)溫室白粉虱和桃蚜的致病性的初步研究［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［9］ 羅小剛.一種重要的昆蟲病原真菌一蠟蚧輪枝孢V.lecanii［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1988（1）：57－64.

［10］ 石艷華，吳偉堅(jiān)，符悅冠.螺旋粉虱成蟲復(fù)眼形態(tài)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)［J］.環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2010，32（1）：41－46.

［11］ 方仲達(dá).致病研究方法［M］.3版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998：343－344.

［12］ 張仙紅，賀運(yùn)春，王建明，等.蠟蚧輪枝菌對(duì)害蟲致病性的初步研究［J］.植物保護(hù)，2001，27（1）：44－46.

［13］ Chouvenc T，Su N Y，Robert A.Cellular encapsulation in the eastern subterranean termite，Reticulitermes flavipes（Isoptera），against infection by the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae［J］.J.Invertebr.Pathol.，2009，101（3）：234－241.

［14］ Khaehatourians G G.Bioehemistry and molecular biology of entomopathoogenic fungi［J］.In The MycotaV1.（ED.Miler，J.D.）.SPringe－Verlag：Berlin Heidelberg，1996：331－363.

［15］ 張亞平，周天雄，楊美林.濕度對(duì)蠟蚊輪枝菌KM9803菌株芽生孢子及分生孢子萌發(fā)的影響［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（2）：243－245.

［16］ 劉召，雷仲仁，花保禎，等.煙粉虱感染白僵菌后的組織病理變化［J］.植物保護(hù)，2006，32（3）：52－54.

［17］ 馮明光，李增智.輪枝孢及其應(yīng)用有害生物的微生物防治原理與技術(shù)［M］.武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1995：256－263.

［18］ 孟艷瓊.蠟蚧輪枝孢的生物學(xué)特性及防治溫室桃蚜的研究［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003：35－45.

［19］ 李國(guó)霞，郭友中，茅洪新，等.應(yīng)用蠟蚧輪枝菌對(duì)大棚蔬菜蚜蟲防治效果的研究［J］.中國(guó)病毒學(xué)，2000，15：262.

［20］ 洪華珠，武覷文.致病病理學(xué).昆蟲真菌學(xué)［M］.合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，1996：93－110.

［21］ 張愛文，鄧春生，農(nóng)向群，等.亞洲玉米螟感染白僵菌后組織病理學(xué)研究［J］.生物防治通報(bào)，1994，10（4）：151－156.

［22］ 宋玉梅，王云濱，李瑞軍，等.甜菜夜蛾感染白僵菌、綠僵菌后的病癥及組織病理學(xué)變化［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21（B11）：171－174.

［23］ 張艷梅，謝映平，薛皎亮，等.油松毛蟲受白僵菌感染的組織病理學(xué)變化［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2011，54（5）：531－539.

［24］ 王音，雷仲仁，張青文，等.小菜蛾感染綠僵菌后的病征及組織病理變化［J］.中國(guó)生物防治，2004，20（3）：156－160.

［25］ 鄭麗霞，吳偉堅(jiān)，符悅冠.螺旋粉虱成蟲觸角的感器［J］.昆蟲知識(shí)，2012，47（3）：525－528.