毛細(xì)管柱內(nèi)在線反應(yīng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定抗壞血酸

楊維平，鄭行望

(1 陜西師范大學(xué) 民族教育學(xué)院，陜西 西安 710062；2 陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710119)

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毛細(xì)管柱內(nèi)在線反應(yīng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定抗壞血酸

楊維平1，鄭行望2

(1 陜西師范大學(xué) 民族教育學(xué)院，陜西 西安 710062；2 陜西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710119)

建立了一種毛細(xì)管柱內(nèi)反應(yīng)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離化學(xué)發(fā)光檢測(cè)痕量抗壞血酸的新方法。方法基于酸性重鉻酸鉀在毛細(xì)管柱內(nèi)與抗壞血酸發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成具有化學(xué)發(fā)光催化活性的Cr(Ⅲ), 通過(guò)毛細(xì)管電泳分離化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)Cr(Ⅲ)間接地測(cè)定抗壞血酸的含量。電泳緩沖液由0.02 mol/L HAc-NaAc (pH 4.7) 和1×10-3mol/L EDTA溶液組成。對(duì)影響分離和檢測(cè)的各參數(shù)都進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?？箟难釞z測(cè)限(3σ)為6×10-11mol/L。該方法具有簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，可用于血液中痕量抗壞血酸的測(cè)定。

毛細(xì)管電泳； 化學(xué)發(fā)光； 抗壞血酸； 柱內(nèi)還原

抗壞血酸(維生素C)是一種重要的維生素，其參與一系列重大的生理過(guò)程并涉及電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，膠原蛋白的形成，抗氧化劑活性，鐵的吸收，細(xì)胞化合物的合成，羥基化作用以及芳香氨基酸的氧化分解代謝作用等?？箟难岬臏y(cè)定在臨床上，藥物以及食品應(yīng)用上均具有重大的意義。抗壞血酸的檢測(cè)通常的方法有：酶催化動(dòng)力學(xué)光度法[1], 熒光動(dòng)力學(xué)法[2-3]，毛細(xì)管電泳(CE)法[4]等。近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光法(CL)測(cè)定抗壞血酸已有報(bào)道[5-7]，然而，化學(xué)發(fā)光法的缺點(diǎn)主要體現(xiàn)在缺乏選擇性。將高效率的毛細(xì)管電泳(CE)分離技術(shù)結(jié)合高靈敏度的(電)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)已成為一種有效的分析方法[8]。

毛細(xì)管柱內(nèi)電泳反應(yīng)是指在高壓電場(chǎng)的作用下，利用分析物區(qū)帶在毛細(xì)管柱內(nèi)的遷移速度與反應(yīng)物質(zhì)區(qū)帶的遷移速度不同，遷移速度大的物質(zhì)區(qū)帶進(jìn)入遷移速度小的物質(zhì)區(qū)帶時(shí), 兩個(gè)區(qū)帶物質(zhì)間相互作用生成新物質(zhì)的反應(yīng)。其特點(diǎn)是反應(yīng)過(guò)程在毛細(xì)管柱內(nèi)在線完成并且與毛細(xì)管電泳的分離過(guò)程同時(shí)進(jìn)行。由于毛細(xì)管柱內(nèi)(In-capillary)反應(yīng)技術(shù)較常規(guī)的毛細(xì)管柱前 (Pre-capillary) 或毛細(xì)管柱后 (Post-capillary)反應(yīng)技術(shù)在重現(xiàn)性及靈敏度等方面均顯示出優(yōu)越性，因而受到極大的關(guān)注[9-12]。本工作提出了一種毛細(xì)管柱內(nèi)反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光測(cè)定痕量抗壞血酸的新方法。采用毛細(xì)管柱內(nèi)區(qū)帶穿通技術(shù)(Zone-passing Technique)，通過(guò)酸性重鉻酸鉀與抗壞血酸在毛細(xì)管柱內(nèi)在線反應(yīng)生成Cr(Ⅲ)離子，利用Cr(Ⅲ)離子催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)柱后抗壞血酸的檢測(cè)。此方法測(cè)定抗壞血酸快速，簡(jiǎn)便，靈敏度高，所得結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光分析儀由陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室組裝(圖1所示)。IFFM-A型化學(xué)數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(西安瑞邁電子科技有限公司)。毛細(xì)管(河北永年光纖廠)：分離毛細(xì)管60 cm×75 μm I.D.；反應(yīng)毛細(xì)管15 cm×530 μm I.D.；發(fā)光劑注射毛細(xì)管25 cm×250 μm I.D.。高速離心機(jī)(德國(guó) Hermle 公司)；微超濾管(德國(guó) Hermle 公司)。新毛細(xì)管使用前用0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl各沖洗10 min,然后再用二次蒸餾水沖洗,注入電泳緩沖液, 靜置24 h后備用。

魯米諾(分析純,陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院)5.0×10-2mol/L；過(guò)氧化氫(優(yōu)級(jí)純,上海桃浦化工廠)0.1 mol/L；抗壞血酸(分析純，西安化學(xué)試劑廠)配制成1×10-2moL/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；NaOH-NaHCO3緩沖液：0.1 moL/L，用前稀釋適當(dāng)濃度；HCl溶液：1 mol/L。

化學(xué)發(fā)光試劑：由0.1 mol/LNaBr、1×10-4mol/L EDTA、1×10-4mol/L的魯米諾以及1×10-2mol/L過(guò)氧化氫溶液的NaHCO3-NaOH的緩沖液(pH 11.5)組成的混合溶液。化學(xué)發(fā)光試劑溶液通過(guò)氣動(dòng)毛細(xì)管均勻地注入反應(yīng)毛細(xì)管中。電解緩沖溶液：含1×10-3mol/L EDTA的0.02 mol/L的HAc-NaAc緩沖液。

所有的溶液都用0.45 μm的膜過(guò)濾并用超聲處理過(guò)。

圖1 毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光分析儀示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the CE-CL detector system

1.高壓電源；2.電解槽；3.Pt電極；4.檢測(cè)室；5.光電倍增管；6.放大器；7.計(jì)算機(jī)；8.反應(yīng)毛細(xì)管；9.電泳毛細(xì)管；10.T型連接管；11.CL試劑毛細(xì)管；12.CL試劑；13.氣流管；14.氣流控制系統(tǒng)；15.N2高壓瓶；16.廢液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 CE在線分離模式

2Cr3++3C6H6O6+7H2O。

圖2 在線柱內(nèi)反應(yīng)和毛細(xì)管電泳分離模式Fig.2 The procedures of online in-capillary reaction and CE separation

a. 柱端溶液注入順序：樣品，鹽酸，重鉻酸鉀; b. 在電場(chǎng)作用下，樣品與酸性重鉻酸鉀柱內(nèi)反應(yīng)生成Cr(Ⅲ)離子的過(guò)程。

2.2 分離條件的選擇

實(shí)驗(yàn)采用NaAc-HAc作為電解緩沖液，研究了其濃度及pH值對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著NaAc-HAc濃度的增加，分離度也隨著增加，但濃度過(guò)大時(shí)，因保留時(shí)間也隨之增加導(dǎo)致分子擴(kuò)散引起峰展寬，分離度反而下降，因此選擇NaAc-HAc的濃度為20 mmol/L。pH值為3～6時(shí)，隨著pH的增加，分離度增大，但pH值過(guò)大時(shí)，體系的離子強(qiáng)度增大，導(dǎo)致基線不穩(wěn)，不利于檢測(cè)；所以選用pH=5.5左右。又研究了電泳電壓對(duì)分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電壓較低時(shí)，分離時(shí)間長(zhǎng)；隨著電泳電壓的增大，電流值也隨之增大，體系的焦耳熱明顯增大，影響分離的重現(xiàn)性和檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用的分離電壓為15 kV。

2.3 化學(xué)發(fā)光條件的選擇

2.3.1 Luminol溶液及其pH值的影響 實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)采用NaOH-NaHCO3緩沖溶液作介質(zhì)時(shí)，體系穩(wěn)定性好，且當(dāng)pH值在11.5左右時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度最好，故本實(shí)驗(yàn)選用pH值為11.5的NaOH-NaHCO3緩沖溶液作為L(zhǎng)uminol及化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的介質(zhì)。

2.3.2 發(fā)光試劑濃度的影響及其穩(wěn)定性 實(shí)驗(yàn)表明，隨著魯米諾濃度的增加，發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)。當(dāng)魯米諾濃度為5×10-4mol/L, 發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)，再繼續(xù)增大魯米諾濃度，發(fā)光信號(hào)反而降低。實(shí)驗(yàn)表明，隨H2O2濃度改變出現(xiàn)最大峰值發(fā)光信號(hào)對(duì)應(yīng)的H2O2濃度為0.01 mol/L。對(duì)發(fā)光反應(yīng)試劑的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)表明，魯米諾與過(guò)氧化氫的混合溶液在10 h內(nèi)對(duì)反應(yīng)發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定無(wú)影響，超過(guò)10 h后發(fā)光強(qiáng)度值略有降低。而發(fā)光反應(yīng)試劑穩(wěn)定在10 h以內(nèi)足以滿足分析測(cè)試所需的時(shí)間。

圖3 空白液(a)和抗壞血酸(b)的電泳圖譜Fig.3 The electrophoregrams for the blank(a) and ascorbic acid(b)

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)表明，在以20 mmol/L HAc-NaAc及1×10-3mol/L EDTA為電解液的電泳體系中，對(duì)于1×10-9mol/L濃度的抗壞血酸溶液，常見(jiàn)金屬離子的干擾情況如下：1 000倍量的Pb2+、Ca2+、Al3+、Hg2+，100倍量的Ni2+、Zn2+、Cd2+、Mg2+、Ba2+、Mo(Ⅵ)、Cu2+、Mn2+、Fe3+不干擾測(cè)定，1倍量的Cr3+產(chǎn)生正峰，但其遷移時(shí)間先于抗壞血酸，因而不干擾抗壞血酸的測(cè)定。

2.5 工作曲線、檢測(cè)限和精密度

在最佳條件下, 測(cè)定抗壞血酸的線性范圍為1.0×10-10～1.0×10-8mol/L, 線性方程為Y=53.1+1.78×1010X, 相關(guān)系數(shù)R=0.993?？箟难岬臋z測(cè)限為6.0×10-11mol/L。對(duì)1×10-9mol/L 的抗壞血酸進(jìn)行5次測(cè)定，遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)為2.6, 峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)為4.5。

2.6 分析方法的應(yīng)用

取2 mL健康成人血樣于微超濾離心管中，在離心機(jī)上以10 000 r/min離心10 min后，血漿中的蛋白質(zhì)等大分子被超濾除去，得到無(wú)色血清，然后按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定血清中抗壞血酸的含量。樣品圖譜如圖4。分析結(jié)果列于表1。

圖4 血清樣品電泳圖譜Fig.4 The electrophoregram for the blood serum a.未知峰；b.抗壞血酸峰。

表1 血樣中抗壞血酸的測(cè)定值*Tab.1 Determination of ascorbic acid in blood serum

*三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值；D為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)論

建立了一種毛細(xì)管電泳柱內(nèi)反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)血樣中痕量抗壞血酸的新方法。此方法利用毛細(xì)管電泳分離的同時(shí)，在毛細(xì)管柱內(nèi)以Cr(Ⅵ)作為氧化劑在線氧化抗壞血酸生成對(duì)Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光體系具有催化活性的Cr(Ⅲ)離子，進(jìn)而柱后間接測(cè)定抗壞血酸。此方法用于血樣中抗壞血酸的測(cè)定，靈敏度高，選擇性好，所得結(jié)果令人滿意。

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〔責(zé)任編輯 王 勇〕

Determination of ascorbic acid based on the combination of capillary electrophoresis and chemiluminescence

YANG Weiping1，ZHENG Xingwang2

(1 School of Ethnic Education，Shaanxi Normal University, Xi′an 710062, Shaanxi, China; 2 School of Chemistry and Chemical Engineering, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119, Shaanxi, China)

A sensitive method for the determination of ascorbic acid based on the combination of electrophoresis separation and chemiluminescence was developed.The method was based on the reduction of Cr(Ⅵ) to Cr(Ⅲ) with ascorbic acid occurring inside the capillary and the light emission produced by luminol oxidation by hydrogen peroxide in basic aqueous solution catalyzed by Cr(Ⅲ).Running buffer was composed of 0.02 mol/L HAc-NaAc (pH 4.7) with 1×10-3mol/L EDTA,and parameters affecting CE-CL separation and detection were optimized.The limit of detection for ascorbic acid (3σ) was 6×10-11mol/L.This method offered potential advantages of simplicity, sensitivity, selectivity and applicability to the determination of ascorbic acid in blood samples.

capillary electrophoresis； chemiluminescence； ascorbic acid； in-capillary reaction

1672-4291(2015)03-0043-04

10.15983/j.cnki.jsnu.2015.03.331

2014-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(111752670)

楊維平，男，教授，主要研究方向?yàn)槊?xì)管電泳及發(fā)光分析。E-mail:wpy@snnu.edu.cn

O657.3

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