大黃游離蒽醌對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用

王棟棟，何素梅，張冠英，尹 弟，黃 欣，陳麗娟，陳 肖，魏 彤，魏群利,2，么煥開,3

(徐州醫(yī)學(xué)院 1. 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室,2. 臨床藥理學(xué)教研室,3. 中藥教研室,江蘇 徐州 221004)

大黃游離蒽醌對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用

王棟棟1，何素梅1，張冠英1，尹 弟1，黃 欣1，陳麗娟1，陳 肖1，魏 彤1，魏群利1,2，么煥開1,3

(徐州醫(yī)學(xué)院 1. 江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點實驗室,2. 臨床藥理學(xué)教研室,3. 中藥教研室,江蘇 徐州 221004)

目的 探討大黃游離蒽醌(free anthraquinone from rhubarb, FAR)對糖尿病大鼠心肌CTGF和collagen表達及間質(zhì)纖維化的影響。方法 健康♂SD大鼠一次性腹腔注射STZ制備糖尿病大鼠模型，2周后隨機分為模型對照組(DCM組)和大黃游離蒽醌干預(yù)組(FAR組)，同時設(shè)立正常對照組(CON組)；干預(yù)8周后檢測大鼠空腹血糖；心臟質(zhì)量指數(shù)；Masson染色觀察心肌纖維化程度；RT-PCR法檢測CTGF、procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表達；免疫組化法檢測CTGF蛋白含量；ELISA法檢測collagen Ⅰ和collagen Ⅲ膠原含量。結(jié)果 與CON組相比，DCM組大鼠空腹血糖、心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌纖維化程度以及CTGF、collagen I和collagen Ⅲ表達均明顯升高；與DCM相比，F(xiàn)AR組心臟質(zhì)量指數(shù)、心肌纖維化程度以及CTGF、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達均明顯下降。結(jié)論 大黃游離蒽醌可通過調(diào)低糖尿病大鼠心肌組織CTGF的表達，減少心肌間質(zhì)中collagen I和Ⅲ 合成及沉積，從而改善糖尿病心肌病大鼠早期的心肌纖維化。

大黃游離蒽醌；糖尿??；心肌病；CTGF；纖維化；Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病的慢性并發(fā)癥之一，其中心肌纖維化在糖尿病性心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[1]。機體的高糖環(huán)境是糖尿病性心肌病的始動因素[2]，其病理學(xué)表現(xiàn)為心臟成纖維細胞數(shù)量的增加，心肌間質(zhì)中膠原沉積增多、各型比例失調(diào)和排列紊亂，其中主要是collagen Ⅰ和collage Ⅲ明顯增多[3-4]。

大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖，其主要活性成分是蒽醌類衍生物。其中，游離的羥基蒽醌類化合物有大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等。近年來研究發(fā)現(xiàn)，大黃游離蒽醌具有治療糖尿病腎病的作用[5-8]。然而大黃游離蒽醌對糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化的影響鮮見報道，本實驗通過鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，觀察大黃游離蒽醌對DCM心肌間質(zhì)纖維化的影響，并探討其減輕DCM心肌間質(zhì)纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康SD大鼠30只，♂，體質(zhì)量(250±20) g，SPF級，購自徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，使用許可證號：SYXK(蘇)2010-0011。

1.2 藥品與儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司，批號：wxbb2432v)；大黃游離蒽醌(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號：ZL20140522DH)；超敏兔兩步法檢測試劑盒(北京中杉金橋，批號：K142716D)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋，批號：K146909E)；兔抗CTGF 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：941246)；大鼠I型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R & B公司，批號：201409)；大鼠Ⅲ型膠原酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國R & B公司，批號：201408)；Masson三色染色液(上海源葉生物科技有限公司)；CTGF、procollagen I、collagen Ⅲ及β-actin引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)。One Touch 血糖儀(美國強生醫(yī)療器材有限公司)；BX43F型正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)(美國Carestream公司)。

1.3 分組與給藥♂SD大鼠30只，隨機分為正常對照組(CON組，8只)和造模組(22只)，造模組腹腔注射60 mg·kg-1STZ，正常對照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。注射后72 h尾靜脈測定空腹血糖，血糖 ≥ 16.7 mmol·L-1且穩(wěn)定2周者為造模成功，共16只。將成模大鼠隨機分為糖尿病心肌病模型組(DCM組，8只)及大黃游離蒽醌組(FAR組，8只)。每日上午9 ∶00時灌胃給藥1次，大黃游離蒽醌于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羧甲基纖維素鈉中配成混懸液，給藥劑量為50 mg·kg-1，正常對照組和糖尿病心肌病模型組給予等體積的羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖測定 干預(yù)8周后，禁食不禁水8 h，經(jīng)尾靜脈測空腹血糖。

1.4.2 心臟質(zhì)量指數(shù)的測定 處死大鼠前稱量大鼠的體重；乙醚麻醉大鼠，迅速取出心臟，冰鹽水沖洗，濾紙吸干，稱量心臟質(zhì)量，計算心臟質(zhì)量指數(shù)(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量，mg/g)。

1.4.3 心肌組織Masson染色 取左心室心肌組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制作切片，連續(xù)切片(厚4 μm)，每5張取1張，每個標(biāo)本取3張切片。脫蠟后行Masson染色，光鏡下觀察心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍綠色，每張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機選取4個視野拍照，用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比。

1.4.4 RT-PCR法檢測心肌組織中CTGF、procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表達 于-80 ℃ 冰箱取出心肌組織，按TRIzol試劑說明書方法提取心肌組織總RNA。取1 μg進行RT-PCR反應(yīng)。所用 RT-PCR擴增引物見Tab 1(β-actin為內(nèi)參照)。每個前膠原蛋白分子的N端和C端分別含有1個前肽，成熟時前膠原蛋白分子經(jīng)胞吐作用被分泌至細胞外，受前膠原肽酶的作用，去除N端和C端的前肽，形成膠原。因此，collagen I的表達水平可以用心肌組織Ⅰ型前膠原蛋白(procollagen Ⅰ)水平表示。CTGF及β-actin變性、退火和延伸溫度分別為94 ℃、60 ℃、72 ℃，反應(yīng)時間分別為30、30、60 s；procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ變性、退火和延伸溫度分別為94 ℃、55 ℃、72 ℃，反應(yīng)時間分別為30、30、60(30 s)，共40個循環(huán)。循環(huán)完畢再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，用GL2200Pro型凝膠成像系統(tǒng)對每一標(biāo)本的PCR產(chǎn)物擴增的特異性片段進行灰度掃描，用CTGF、procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ的灰度值與β-actin的比值表示目的基因CTGF、procollagen Ⅰ及collagen Ⅲ的相對表達量。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4.5 免疫組化法檢測心肌組織CTGF蛋白的含量 取左心室常規(guī)石蠟包塊制作切片，連續(xù)切片(厚4 μm)，每5張取1張，每個標(biāo)本取3張切片。采用免疫組織化學(xué)法檢測心肌組織中CTGF含量，具體操作按照試劑盒說明書進行?？贵w按1 ∶100 的方法稀釋，以 PBS 替代一抗作為陰性對照，將切片置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并隨機選取4個視野拍照，陽性區(qū)出現(xiàn)棕黃色顆粒，用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測量CTGF的平均積分吸光度。

1.4.6 ELISA法檢測心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ膠原含量 采用ELISA法檢測心肌組織中CTGF含量，具體操作按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖和心臟質(zhì)量指數(shù)與CON組相比，DCM組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)升高(P<0.01)。與DCM組相比，F(xiàn)AR組心臟質(zhì)量指數(shù)下降(P<0.01)。表明糖尿病大鼠已出現(xiàn)心肌肥厚，大黃游離蒽醌可減輕糖尿病所致心肌肥厚(Tab 2)。

GroupBloodglucose/mmol·L-1HMI/mg·g-1CON4.46±0.423.50±0.32DCM24.03±4.67**4.12±0.29**FAR22.65±5.813.63±0.14##

**P<0.01vsCON group；##P<0.01vsDCM group

2.2 心肌組織Masson染色各組心肌組織Masson染色，見Fig 1。CON組大鼠左心室心肌間血管和心肌間質(zhì)可見少許膠原纖維沉積。DCM大鼠的膠原纖維沉積更加明顯。FAR組膠原沉積有所減輕。用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)測量膠原纖維陽性區(qū)占所觀察視野的面積比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與CON組相比，DCM組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多(P<0.01)；與DCM比，F(xiàn)AR組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯減少(P<0.05)。

Fig 1 Effects of FAR on myocardial fibrosis in

**P<0.01vsCON group;#P<0.05vsDCM group.

2.3 心肌組織RT-PCR結(jié)果與CON組相比，DCM組大鼠心肌組織CTGF、procollagen I和collagen Ⅲ mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；與DCM相比較，F(xiàn)AR組大鼠心肌組織CTGF、procollagen I和collagen Ⅲ mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，說明FAR有抑制CTGF、procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表達的作用，見Fig 2。

Fig 2 Effects of FAR on expressions of CTGF, procollagen Ⅰ and collagen Ⅲ mRNA in myocardial tissues of diabetic ±s,n=6)

*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsDCM group.

2.4 免疫組化法檢測心肌組織CTGF蛋白的含量CON組大鼠左心室心肌組織CTGF低表達，陽性顆粒散在，染色較淺；DCM組高表達，棕黃色信號強，融合成片，而FAR組表達明顯降低，見Fig 3。用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理系統(tǒng)分別測量每張切片CTGF的平均積分吸光度，結(jié)果如下：與CON組相比，CTGF的表達在DCM組中明顯升高(P<0.05)；與DCM組相比，F(xiàn)AR組的CTGF表達明顯降低(P<0.05)。

2.5 ELISA法檢測心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ膠原含量與CON組相比，DCM組的collagen Ⅰ及collagen Ⅲ的含量增加(P<0.01)；與DCM組相比，F(xiàn)AR組的collagen Ⅰ及collagen Ⅲ的含量有所下降，見Fig 4。

3 討論

糖尿病性心肌病是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，以舒張功能不全為早期臨床表現(xiàn)，晚期以收縮功能障礙為主[9-10]，最終可導(dǎo)致心力衰竭。有研究表明，左心室舒張功能降低、泵血功能異常與其心肌間質(zhì)纖維化有關(guān)[4,11]。正常心肌細胞外基質(zhì)中的膠原主要為I型及Ⅲ型，I型約占心肌膠原總數(shù)的80%，纖維粗，有較大的僵硬度和很強的抗?fàn)坷匦远糜诒３质冶诘膹姸?；Ⅲ型膠原約占11%，纖維較細，伸展性和彈性大，與室壁彈性有關(guān)。異常增多且比例失調(diào)的膠原纖維使心室壁的順應(yīng)性下降，僵硬度增加，舒張期充盈受限；如果心肌纖維化進一步加重，勢必?fù)p害心肌的收縮功能[12]。

Fig 3 Effects of FAR on expression of CTGF protein in myocardial tissues of diabetic ±s,n=6)

*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsDCM group.

Fig 4 Effects of FAR on depositions of collagen type I and collagen type Ⅲ in myocardial tissues of diabetic ±s,n=6)

**P<0.01vsCON group;#P<0.05,##P<0.01vsDCM group.

CTGF是一類能夠調(diào)節(jié)機體有關(guān)組織生長的細胞因子。CTGF基因?qū)偌纯淘缙诨颍瑔幼雍D(zhuǎn)化生長因子TGF-β應(yīng)答元件，可被TGF-β選擇性誘導(dǎo)激活，它通過促進細胞增殖，直接誘導(dǎo)膠原生成，促進細胞黏附等自身的生物學(xué)效應(yīng)參與纖維化的發(fā)生與發(fā)展，因此CTGF是檢測體內(nèi)纖維化的有效指標(biāo)[13-16]。

我們研究證實糖尿病大鼠心肌纖維化同時伴隨CTGF的高表達，與Way等[17]和Hagendomm等[18]研究一致。在本實驗中，Masson 染色示糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維增生，心肌組織中procollagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA表達明顯增強，Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維的含量亦明顯升高，提示糖尿病大鼠已存在心肌纖維化。大黃游離蒽醌干預(yù)8周后，糖尿病大鼠心肌纖維化程度有所改善，心肌CTGF、Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維的表達亦明顯減少，提示大黃游離蒽醌的抗心肌纖維化可能與抑制CTGF的表達進而減少Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維的合成有關(guān)。

綜上所述，糖尿病心肌纖維化與心肌CTGF過度表達有關(guān)，F(xiàn)AR可通過下調(diào)糖尿病大鼠心肌組織CTGF的表達，減少心肌間質(zhì)中collagen Ⅰ和Ⅲ 合成及沉積，從而改善糖尿病心肌病大鼠早期的心肌纖維化。

[1] 喬 進, 竇志華, 吳 鋒, 等. 靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病大鼠心肌AGEs及CTGF的影響及其機制[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014, 30(4): 536-41.

[1] Qiao J, Dou Z H, Wu F, et al. Effect of combination of ganoderma lucidum polysaccharide and metformin on AGEs and CTGF of cardiac muscle in type 2 diabetic rats and the mechanism[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(4): 536-41.

[2] 周慶峰, 王洪新, 王桂君, 等. 高糖對去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的促進作用 [J]. 中國藥理學(xué)通報, 2003, 19(9):1054-7.

[2] Zhou Q F, Wang H X, Wang G J, et al. Accelerating effects of high glucose on NE-induced cardiac hypertrophy of the cultured myocardial cells [J].ChinPharmacolBull, 2003, 19(9): 1054-7.

[3] 王 婧, 符麗娟, 閆 睿. 曲尼司特對糖尿病大鼠心肌纖維化的作用 [J]. 中國藥理學(xué)通報, 2013,29(6): 837-41.

[3] Wang J, Fu L J, Yan R. Effects of tranilast on myocardial fibrosis of diabetic rats [J].ChinPharmacolBull, 2013,29(6): 837-41.

[4] Maya L, Villarreal F J. Diagnostic approaches for diabetic cardiomyopathy and myocardial fibrosis [J].JMolCellCardiol, 2010, 48(3): 524-9.

[5] Zheng J M, Zhu J M,Li L S, et al. Rhein reverses the diabetic phenotype of mesangial cells over-expressing the glucose transporter (GLUT1) by inhibiting the hexosamine pathway [J].BrJPharmacol, 2008, 153(7): 1456-64.

[6] Li X, Liu W,Wang Q,et al. Emodin suppresses cell proliferation and fibronectin expression via p38MAPK pathway in rat mesangial cells cultured under high glucose [J].MolCellEndocrinol,2009, 307(1-2): 157-62.

[7] Gao J,Wang F,Wang W,et al. Emodin suppresses hyperglycemia-induced proliferation and fibronectin expression in mesangial cells via inhibiting cFLIP [J].PLoSOne, 2014, 9(4): e93588.

[8] Gao Q,Qin W S,Jia Z H,et al. Rhein improves renal lesion and ameliorates dyslipidemia in db/db mice with diabetic nephropathy [J].PlantaMed,2010, 76(1): 27-33.

[9] Schannwell C M, Schneppenhei M, Perimgs S, et al. Left ventricular diastolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy [J].Cardiology, 2002, 98(1-2): 33-9.

[10] Sajad A H, billal P, Rajdeep S, et al. Diabetic cardiomyopathy: mechanisms, diagnosis and treatment [J].ClinSci, 2004, 107: 539-57.

[11] de Souza R R. Aging of myocardial collagen [J].Biogerontology, 2002, 3(6): 325-35.

[12] 高淑卿, 朱鵬立. 心肌纖維化的研究進展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2009, 15(11): 1627-9.

[12] Gao S Q, Zhu P L. Research advance of myocardial fibrosis [J].MedRecap, 2009, 15(11): 1627-9.

[13] Kothapalli D, Grotendorst G R. CTGF modulates cell cycle progression in cAMP-arrested NRK fibroblasts [J].JCellPhysiol, 2000, 182(1):119-26.

[14] Gore-Hyer E, Shegogue D, Markiewicz M, et al. TGF-β and CTGF have overlapping and distinct fibrogenic effects on human renal cells [J].AmJPhysiolRenalPhysiol, 2002, 283(4): 707-16.

[15] Dendooven A, Gerritsen K G, Nguyen T Q, et al. Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) ELISA: a novel tool for monitoring fibrosis [J].Biomarkers, 2011, 16(4): 289-301.

[16] Khankan R, Oliver N, He S, et al. Regulation of fibronectin-EDA through CTGF domain-specific interactions with TGFβ2 and its receptor TGFβRII [J].InvestOphthalmolVisSci, 2011, 52(8): 5068-78.

[17] Way K J, Isshiki K, Suzuma K, et al. Expression of connective tissue growth factor is increased in injured myocardium associated with protein kinase C beta2 activation and diabetes [J].Diabetes, 2002, 51(9): 2709-18.

[18] Hagendomm J, Padera T P, Yock T I, et al. Plateler-derived growth factor receptor-beta in Gorham s disease [J].MatClinPractOncol, 2006, 3(12): 693-7.

Effects of FAR on myocardial fibrosis of diabetic rats

WANG Dong-dong1, HE Su-mei1, ZHANG Guan-ying1, YIN Di1, HUANG Xin1, CHEN Li-juan1,CHEN Xiao1, WEI Tong1, WEI Qun-li1,2, YAO Huan-kai1,3

(1.JiangsuKeyLaboratoryofNewDrugResearchandClinicalPharmacy，XuzhouMedicalCollege，XuzhouJiangsu221004,China;2.DeptofClinicalPharmacology，XuzhouMedicalCollege，XuzhouJiangsu221004,China; 3.DeptofTraditionalChineseMedicine，XuzhouMedicalCollege，XuzhouJiangsu221004,China)

Aim To study the effects of Free Anthraquinone from Rhubarb (FAR) on myocardial CTGF and collagen expression and interstitial fibrosis in diabetic rats. Methods The male SD rats were randomly divided into normal group (CON), diabetic cardiomyopathy group (DCM) and FAR treatment group (FAR). Streptozocin was intraperitoneally injected into the animals in the latter 2 groups to induce diabetic rat model. The model was expected to be stable for 2 weeks before the treatment. At the end of the 8th week in treatment, fasting plasma glucose and heart mass index were measured. Masson staining was used to observe the myocardial fibrosis. RT-PCR was used to detect the mRNA levels of CTGF, procollagen type Ⅰ and collagen type Ⅲ. Immunohistochemical method was used to detect the content of CTGF. ELISA was used to detect the depositions of collagen type I and collagen type Ⅲ. Results Compared with CON group, fasting plasma glucose, heart mass index, the degree of myocardial fibrosis, and the expressions of CTGF, collagen type I and collagen type Ⅲ in left ventricular myocardial tissue of DCM group were significantly increased. However, compared with DCM group, fasting plasma glucose, heart mass index, the degree of myocardial fibrosis, and the expressions of CTGF, collagen type I and collagen type Ⅲ in left ventricular myocardial tissue of FAR-treated rats were significantly decreased. Conclusion FAR retards the process of myocardial fibrosis in diabetic rats by down-regulating the expression of CTGF, reducing the synthesis and depositions of collagen type I and collagen type Ⅲ.

Free Anthraquinone from Rhubarb; diabetes; cardiomyopathy; CTGF; fibrosis; collagen Ⅰ, Ⅲ

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.022.html

2014-11-14,

2015-02-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81302744); 江蘇省研究生創(chuàng)新計劃(No CXLX13_999); 江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新計劃(No 201410313024Z); 徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院研究生創(chuàng)新計劃(No 2014YKYCX013)

王棟棟 (1990-)，男，碩士生，研究方向： 內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，E-mail：1084214752@qq.com; 魏群利(1962-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌藥理學(xué)及臨床藥學(xué)，通訊作者，Tel：0516-83262134，E-mail：weiqunli@126.com; 么煥開(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：活性天然產(chǎn)物化學(xué)與生物學(xué)，通訊作者，Tel：0516-83262140，E-mail：hkyao@xzmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.014

A

1001-1978(2015)04-0509-05

R-332；R284.1；R322.11；R587.2；R542.2