促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1拮抗劑CP154526對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

周 毅，劉 巍，張 悅

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、2.病理學(xué)教研室、3.臨床診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體1拮抗劑CP154526對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

周 毅1，劉 巍2，張 悅3

(河北醫(yī)科大學(xué) 1.第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、2.病理學(xué)教研室、3.臨床診斷學(xué)教研室，河北 石家莊 050017)

目的 觀察促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)受體1拮抗劑CP154526對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響。方法 原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元，噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞存活率，然后分為4組：正常對(duì)照組(Con)、CRH刺激組(CRH)、CRH和CP154526共同刺激組(CRH+CP)、CP154526刺激組(CP)。TUNEL、流式細(xì)胞術(shù)Annexin Ⅴ-PI法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡率；Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 10-8mol·L-1的CRH作用于海馬神經(jīng)元后，細(xì)胞存活率下降(P<0.05)；50 mmol·L-1的CP154526可明顯提升神經(jīng)元存活率(P<0.05)。與正常對(duì)照組相比，CRH刺激后神經(jīng)元凋亡率增加，Bax/Bcl-2比值增高，caspase-3表達(dá)增加；加用CP154526可明顯降低神經(jīng)元凋亡率、Bax/Bcl-2比值及caspase-3表達(dá)水平；而單獨(dú)應(yīng)用CP154526對(duì)凋亡沒(méi)有明顯影響。結(jié)論 一定濃度的CRH可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，其受體1拮抗劑CP154526可有效減輕細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素；CP154526；海馬；神經(jīng)元；凋亡；原代培養(yǎng)

應(yīng)激是指機(jī)體在受到內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)、心理因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)，其主要特征是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(hypothalamic pituitary adrenal axis，HPA)的激活為核心的生理和心理反應(yīng)。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)是下丘腦分泌的調(diào)節(jié)HPA軸功能的多肽類激素，也是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)時(shí)發(fā)揮神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激素[1]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，CRH不僅在HPA軸調(diào)節(jié)中起著重要作用，作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，其在情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)系統(tǒng)損傷與發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用[2]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的CRH可以降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率，并且呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴模式[3]。CRH通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)作用，CRH受體1(CRH-R1)主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如下丘腦、海馬、大腦皮層、杏仁體、藍(lán)斑等部位，與CRH有較高的親和力[4]。在應(yīng)激狀態(tài)下，CRH主要通過(guò)CRH-R1發(fā)揮內(nèi)分泌、行為改變和內(nèi)臟反應(yīng)等功能的調(diào)節(jié)作用[5-7]，但有關(guān)CRH-R1發(fā)揮作用的方式尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CRH-R1拮抗劑CP154526，重點(diǎn)探討其對(duì)海馬神經(jīng)元凋亡的影響，以期明確CRH-R1在CRH誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡中的作用，為應(yīng)激所致精神損傷的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 新生24 h內(nèi)SD大鼠，♂♀不限，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Cellgro)、Neurobasal培養(yǎng)基(Gibco)、B27(PAA)。CRH(Anaspec)，CP154526(Tocris Bioscience，Bristol)，0.25%胰蛋白酶(Sigma)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，Sigma)。兔抗MAP2一抗(Cell Signaling)，兔抗Bax、Bcl-2多克隆抗體(Protein Tech)，鼠抗caspase3單克隆抗體(Cell Signaling)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TUNEL試劑盒(Roche)。Annexin Ⅴ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物)。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 新生24 h內(nèi)SD乳鼠，75%乙醇消毒，無(wú)菌條件下斷頭、取雙側(cè)海馬，解剖顯微鏡下去除血管及腦膜，剪碎后以0.125%胰蛋白酶消化15 min，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 mm口徑吸管吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋成1×106ml-1的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板(預(yù)先經(jīng)0.1%多聚賴氨酸鋪底)，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，3 h后補(bǔ)種植液，24 h后去除種植液，加入培養(yǎng)液(Neurobasal+B27)培養(yǎng)，每3 d換液，培養(yǎng)6～8 d神經(jīng)細(xì)胞之間突觸聯(lián)成網(wǎng)狀用于后續(xù)研究[8]。

1.2.2 神經(jīng)元鑒定 取培養(yǎng)7 d海馬神經(jīng)元，70%酒精固定30 min，0.1%Triton 37℃孵育15 min，3%H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉30 min，兔抗MAP2一抗1 ∶200稀釋，4℃過(guò)夜，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗37℃孵育2 h，PBS沖洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞懸液200 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度的CRH(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol·L-1)作用48 h后，每孔加5 g·L-1MTT溶液20 μL，37℃孵育4 h后小心吸出上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl-sulfoxide, DMSO)振蕩10 min，490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞存活率。存活率/%=實(shí)驗(yàn)組A值/空白對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，找到誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元存活率降低的CRH的最低敏感濃度。

用神經(jīng)元培養(yǎng)液將CRH受體1特異性拮抗劑CP154526稀釋至10、50、250 mmol·L-1的終濃度，與CRH共同刺激海馬神經(jīng)元48 h，上述同樣方法檢測(cè)神經(jīng)元存活率，找到CP154526的最低敏感濃度。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為4組：(1)空白對(duì)照組：神經(jīng)元培養(yǎng)液正常培養(yǎng)；(2)CRH組：用MTT結(jié)果中CRH誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的最低敏感濃度培養(yǎng)；(3)CRH+CP組：加入CRH同時(shí)加入CRH受體1拮抗劑CP154526；(4)CP組：只加入CP154526培養(yǎng)。各組培養(yǎng)液量一致，均培養(yǎng)48 h。

1.2.5 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。凋亡神經(jīng)元細(xì)胞核呈綠色熒光。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，計(jì)算出平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)(%)表示凋亡百分率。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 用0.25%胰蛋白酶制備單細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V (Annexin V) / 碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染色標(biāo)記法進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

1.2.7 Western blot檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá) 收集各組細(xì)胞提取總蛋白，每組樣品取50 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入一抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶200)、caspase-3(1 ∶1 000)和β-actin(1 ∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。TTBS洗膜后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠IgG(1:5000)，37℃孵育2 h，TTBS洗膜，滴加ECL發(fā)光劑，于Odyssey FC成像系統(tǒng)中顯影，并對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的形態(tài)特征及鑒定倒置顯微鏡下可見(jiàn)，原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元7 d時(shí)神經(jīng)元胞體豐滿，周圍光暈明顯，立體感強(qiáng)，突起增粗增長(zhǎng)，連接成網(wǎng)狀(Fig 1A)，顯示神經(jīng)元成熟。Fig 1B所示為神經(jīng)元特異性標(biāo)志物MAP2免疫熒光染色，可見(jiàn)神經(jīng)元胞體和突起著色，經(jīng)鑒定神經(jīng)元純度在90%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

Fig 1 Primary culture and immunofluorescence identification of hippocampal neuron

A: morphological characteristics of primary cultivated hippocampal neuron(×200); B: the immunofluorescence identification of hippocampal neuron (×200).

2.2 MTT檢測(cè)神經(jīng)元存活率以正常對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%計(jì)算，不同濃度的CRH刺激海馬神經(jīng)元后，隨著濃度的增大，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)；與正常對(duì)照組相比，濃度為10-8mol·L-1的CRH刺激后，細(xì)胞存活率降低即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，F(xiàn)ig 2A)，故CRH導(dǎo)致神經(jīng)元存活率降低的最低敏感濃度為10-8mol·L-1。

將不同濃度的CRH受體1特異性拮抗劑CP154526分別加入10-8mol·L-1CRH刺激的神經(jīng)元培養(yǎng)基中，可見(jiàn)，隨著濃度的增大，細(xì)胞存活率有所升高，與CRH組相比，50 mmol·L-1的CP154526可明顯提升神經(jīng)元存活率(P<0.05，F(xiàn)ig 2B)。

Fig 2 Cell viability assayed by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsCRH.

2.3 TUNEL檢測(cè)凋亡率TUNEL染色可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，10-8mol·L-1的CRH刺激后凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，加用50 mmol·L-1的CP154526后，凋亡細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。單獨(dú)應(yīng)用CP154526，和正常對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)Fig 3。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率Annexin Ⅴ是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的敏感指標(biāo)之一。流式細(xì)胞儀將收集到的細(xì)胞分為四個(gè)象限，左下象限代表的是活細(xì)胞，右下象限代表的是早期凋亡細(xì)胞，右上象限代表的是晚期凋亡細(xì)胞。早期凋亡和晚期凋亡比率之和作為總的凋亡率。如Fig 4所示，與正常對(duì)照組相比，CRH刺激后神經(jīng)元凋亡率明顯增加(P<0.05)；加用CP154526后，凋亡率明顯降低(P<0.05)；而單獨(dú)應(yīng)用CP154526，與正常對(duì)照組相比，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯變化(P>0.05)。

2.5 Western blot檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果與正常對(duì)照組相比，CRH刺激后，凋亡標(biāo)志蛋白Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)降低，Bax/Bcl-2比值明顯升高(P<0.05)；caspase-3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。加用CP154526后，Bax/Bcl-2比值明顯降低(P<0.05)；caspase-3表達(dá)也明顯降低(P<0.05)。而單獨(dú)應(yīng)用CP154526，Bax/Bcl-2比值和Caspase-3蛋白水平與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)Fig 5。

Fig 3 Neuron apoptotic rates of different groups examined by TUNEL(CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)中，HPA軸激活的中樞控制是十分復(fù)雜的，在這一系列神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)過(guò)程中，下丘腦合成和釋放的CRH起著關(guān)鍵作用，它控制著HPA軸的興奮水平。隨著對(duì)應(yīng)激反應(yīng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)CRH還是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在情緒反應(yīng)、學(xué)習(xí)記憶和神經(jīng)系統(tǒng)損傷與發(fā)育中也有著重要作用[2]。

海馬是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，參與了情緒、學(xué)習(xí)和記憶、行為、免疫等的調(diào)節(jié)，對(duì)應(yīng)激反應(yīng)非常敏感且易損，它的損傷在各種應(yīng)激所致疾患中起到關(guān)鍵作用。研究表明，慢性應(yīng)激可能通過(guò)增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致海馬損害，從而誘發(fā)抑郁癥[9-10]。因?yàn)槲挥诤ｑRCA1區(qū)的錐體細(xì)胞表達(dá)糖皮質(zhì)激素受體，而應(yīng)激狀態(tài)下，腎上腺分泌的糖皮質(zhì)激素可以通過(guò)血腦屏障作用于這些受體，因此，很多學(xué)者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素及其受體介導(dǎo)應(yīng)激對(duì)海馬功能產(chǎn)生影響[11]。但是，當(dāng)腎上腺切除后，慢性應(yīng)激一樣可以影響海馬功能。越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，CRH及其受體參與介導(dǎo)應(yīng)激對(duì)海馬結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[12]。

Fig 4 Neuron apoptotic rates of different groups examined by Annexin V/PI(CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

目前已知的CRH受體有3種，即CRH-R1、CRH-R2和CRH-R3，均屬于G蛋白偶聯(lián)受體。3種受體的功能及與CRH的親和力不盡相同。其中CRH-R1由415～420個(gè)氨基酸組成，與CRH有較高的親和力。CRH-R1 mRNA主要表達(dá)于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如下丘腦、海馬、大腦皮層、杏仁體、藍(lán)斑等部位，在外周的表達(dá)極其有限[4]。大量研究表明，在應(yīng)激狀態(tài)下，CRH主要通過(guò)CRH-R1發(fā)揮內(nèi)分泌、行為改變和內(nèi)臟反應(yīng)等功能的調(diào)節(jié)作用[5-7]。CRH-R2序列與CHR-R1有約70%的同源性，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)有限，而在外周主要表達(dá)在心肌、骨骼肌、胃腸道等部位[13]。CRH-R3最早于2001年被分離出來(lái)，由428個(gè)氨基酸序列組成，但有關(guān)其分布、特性及作用尚不清楚[14]。

Fig 5 Protein expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in different groups examined by Western blot (CRH: 10-8 mol·L-1; CP154526: 50 mmol·L-1)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsCRH.

關(guān)于CRH受體在應(yīng)激中的作用，有研究報(bào)道，應(yīng)用CRH-R1基因敲除鼠，基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下HPA軸功能明顯受損。而邊緣系統(tǒng)CRH-R1對(duì)調(diào)控應(yīng)激時(shí)HPA軸反應(yīng)至關(guān)重要[15]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的CRH可以降低海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率，但CRH的作用是否是通過(guò)其受體1來(lái)發(fā)揮的，及其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用TUNEL、流式Annexin Ⅴ-PI雙標(biāo)染色、Western blot等方法進(jìn)一步證實(shí)，CRH可以導(dǎo)致體外原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，應(yīng)用CRH-R1特異性拮抗劑CP154526可以有效的降低神經(jīng)元凋亡率，說(shuō)明CRH-R1確實(shí)在CRH誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

關(guān)于CP154526降低神經(jīng)元凋亡的可能原因，目前尚無(wú)明確報(bào)道。我們考慮， 可能與CP154526高度親脂性及其半衰期較長(zhǎng)有關(guān)，使得CP154526可與CRH-R1充分結(jié)合，從而抑制了CRH的作用。當(dāng)然，細(xì)胞內(nèi)調(diào)控凋亡的信號(hào)系統(tǒng)精細(xì)復(fù)雜，CP154526具體是如何發(fā)揮其調(diào)控作用的將是我們下一步研究的重點(diǎn)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，應(yīng)激狀態(tài)下，一定濃度的CRH可通過(guò)其受體1誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，而CP154526對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有一定的抑制作用，可為應(yīng)激所致精神損傷的細(xì)胞保護(hù)治療提供新的思路。

[1] Vale W, Spiess J, Rivier C, et al. Characterization of a 41-residue ovine hypothalamic peptide that stimulates secretion of corticotropin and beta-endorphin [J].Science, 1981, 213(4514): 1394-7.

[2] Claes S J. Corticotropin-releasing hormone (CRH) in psychiatry: from stress to psychopathology [J].AnnMed, 2004, 36(1): 50-61.

[3] Zhang Y, Liu W, Ma C, et al. Endoplasmic reticulum stress contributes to CRH-induced hippocampal neuron apoptosis [J].ExpCellRes, 2012, 318(6): 732-40.

[4] Müller M B, Preil J, Renner U, et al. Expression of CRHR1 and CRHR2 in mouse pituitary and adrenal gland: implications for HPA system regulation [J].Endocrinology, 2001, 142(9): 4150-3.

[5] Boqdan R, Santesso D L, Faqerness J, et al. Corticotropin-releasing hormone receptor type 1 (CRHR1) genetic variation and stress interact to influence reward learning [J].JNeurosci, 2011, 31(37): 13246-54.

[6] Wasserman D, Wasserman J, Rozanov V, et al. Depression in suicidal males: genetic risk variants in the CRHR1 gene [J].GenesBrainBehav, 2009, 8(1): 72-9.

[7] Wasserman D, Sokolowski M, Rozanov V, et al. The CRHR1 gene: a marker for suicidality in depressed males exposed to low stress [J].GenesBrainBehav, 2008, 7(1): 14-9.

[8] 肖復(fù)茜, 李洪秀, 隋海娟, 等. 知母皂苷元對(duì)高糖引起的體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(1): 107-12.

[8] Xiao F X, Li H X, Sui H J, et al. Protective effect of Sarsasapogenin against hyperglycemia induced neurotoxicity in cultured hippocampal neurons [J].ClinPharmacolBull, 2013, 29(1): 107-12.

[9] Bachis A, Cruz M I, Nosheny R L, et al. Chronic unpredictable stress promotes neuronal apoptosis in the cerebral cortex [J].NeurosciLett, 2008, 442(2): 104-8.

[10] Lucassen P J, Heine V M, Muller M B, et al. Stress, depression and hippocampal apoptosis [J].CNSNeurolDisordDrugTargets, 2006, 5(5): 531-46.

[11] McEwen B S. Mood disorders and allostatic load [J].BiolPsychiatry, 2003, 54(3): 200-7.

[12] Orozco-Cabal L, Pollandt S, Liu J, et al. Regulation of synaptic transmission by CRF receptors [J].RevNeurosci, 2006, 17(3): 279-307.

[13] Hashimoto K, Makino S, Asaba K, et al. Physiological roles of corticotropin-releasing hormone receptor type 2 [J].EndocrJ,2001, 48(1): 1-9.

[14] Paez-Pereda M, Hausch F, Holsboer F. Corticotropin releasing factor receptor antagonists for major depressive disorder [J].ExpertOpinInvestigDrugs, 2011, 20(4): 519-35.

[15] 曾 純, 嚴(yán) 燦, 徐志偉, 等. 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素受體在應(yīng)激反應(yīng)中的作用研究 [J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(5): 517-20.

[15] Zeng C, Yan C, Xu Z W, et al. Research on the effect of corticotropin-releasing hormone receptors in stress reaction [J].ClinPharmacolBull, 2006, 22(5): 517-20.

Effects of CP154526,the corticotropin releasing hormone receptor 1 antagonist,on rat hippocampal neuron apoptosis

ZHOU Yi1, LIU Wei2, ZHANG Yue3

(1.DeptofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China, 2.DeptofPathologyHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China, 3.DeptofClinicalDiagnostics,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Aim To investigate the effects of CP154526, a corticotropin releasing hormone (CRH) receptor 1 antagonist, on the hippocampal neuron apoptosis. Methods Rat hippocampal neurons were primarily cultured. Cell viability was estimated using MTT assays. Neurons were randomly divided into four groups: Normal cultures (Control); CRH-exposed cultures (CRH); CRH and CP154526 co-exposed cultures (CRH+CP); CP154526-exposed cultures (CP). Cell apoptosis was examined by TUNEL or flow cytometry Annexin Ⅴ-PI staining. The protein levels of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were investigated by Western Blotting. Results 10-8mol·L-1CRH decreased cell viability of cultured hippocampal neuron (P<0.05), while 50 mmol·L-1CP154526 significantly increased neuron viability (P<0.05). Compared with Control group, cell apoptotic rate, the ratio of Bax and Bcl-2 and the protein level of Caspase-3 were elevated in hippocampal neuron induced by CRH. Combined with CP154526 reversed the effects of CRH. Application of CP154526 alone had no obvious effects on cell apoptosis. Conclusions A certain concentration of CRH can induce hippocampal neuron apoptosis, and its receptor 1 antagonist CP154526 can effectively reduce the apoptosis and play a neuroprotective role.

CRH; CP154526; hippocampus; neuron; apoptosis; primary culture

時(shí)間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.021.html

2014-11-09,

2015-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81302625)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究?jī)?yōu)秀青年基金項(xiàng)目(No Y2012001)

周 毅(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，Tel：0311-86265661，E-mail：lwei929@126.com； 張 悅(1978-)，女，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病，通訊作者，Tel：0311-86265661，E-mail：zhyue515@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.013

A

1001-1978(2015)04-0504-06

R-332；R322.81；R329.25；R392.11；R977.11