氯胺酮聯(lián)合氟西汀對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達(dá)的影響

沈一維,律 峰,黎 平,羅 潔,謝 飛,閔 蘇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科, 重慶 400016)

氯胺酮聯(lián)合氟西汀對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達(dá)的影響

沈一維,律 峰,黎 平,羅 潔,謝 飛,閔 蘇

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科, 重慶 400016)

目的 探討氯胺酮聯(lián)合氟西汀對抑郁大鼠行為學(xué)以及對大鼠腦內(nèi)前額葉神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)羧基末端PDZ配體(CAPON)的影響。 方法 健康成年♂ SPF級SD大鼠，體質(zhì)量220～270 g，2.5～3月齡，采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激法建立抑郁模型。選建模成功的大鼠96只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組(n=24)：抑郁對照組(D組)、氯胺酮組(K組)、氟西汀組(F組)及氯胺酮聯(lián)合氟西汀組(KF組)。再根據(jù)給予藥物處理時間的不同，各組隨機(jī)分為2個亞組(n=12)：處理3 d組(D3、K3、F3、KF3)和處理7 d組(D7、K7、F7、KF7)。D組行空白對照處理，K組給予氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射；F組給予氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃；KF組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1灌胃。根據(jù)所在亞組分別給予各組連續(xù)3 d或7 d處理，每天1次。于建模前1 d，建模后1 d及藥物處理結(jié)束后1 d采用曠場實(shí)驗(yàn)和糖水偏好實(shí)驗(yàn)評價其抑郁狀態(tài)。所有行為學(xué)檢測完成后1 d處死大鼠，分別采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR法檢測前額葉nNOS、CAPON蛋白及其mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與建模前比較，各組大鼠建模后水平運(yùn)動距離、直立次數(shù)減少，糖水偏好比下降(P<0.05)，且各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在藥物處理3 d后，與D3組比較，K3組和KF3組水平運(yùn)動距離、直立次數(shù)增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達(dá)下調(diào)，CAPON蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。在藥物處理7 d后，與D7組比較，K7組,F7組和KF7組水平運(yùn)動距離、直立次數(shù)增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達(dá)下調(diào)，CAPON蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與F7組比較，KF7組水平運(yùn)動距離、直立次數(shù)增多，糖水偏好比升高，nNOS及其mRNA表達(dá)下調(diào)，CAPON蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 氯胺酮聯(lián)合氟西汀較單獨(dú)使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強(qiáng)，且抗抑郁起效時間縮短，其機(jī)制可能與氯胺酮聯(lián)合氟西汀可降低大鼠腦內(nèi)前額葉nNOS表達(dá)及升高其配體CAPON的表達(dá)有關(guān)。

氯胺酮；氟西??；抑郁；前額葉；神經(jīng)型一氧化氮合酶；神經(jīng)型一氧化氮合酶羧基末端PDZ配體

抑郁癥是一種高患病率、高致殘率及高自殺率的慢性精神障礙性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，抑郁癥已成為世界第四大疾患，預(yù)計(jì)到2020年，可能成為僅次于冠心病的第二大疾病[1]。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全清楚，而傳統(tǒng)的抗抑郁藥物起效慢且緩解率低[2]，大樣本臨床研究統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，要表現(xiàn)出顯著有效的治療效果常需數(shù)周乃至數(shù)月，且通常僅1/3的病人對單次給藥有效[3]，臨床迫切需要一種起效更迅速，緩解率更高的治療方案。

近年來，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑氯胺酮被發(fā)現(xiàn)具有快速抗抑郁作用[4]，但機(jī)制仍不明確。其傳統(tǒng)的抗NMDA效應(yīng)并不能完全地解釋相關(guān)機(jī)制。而選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑氟西汀是臨床最常用的抗抑郁藥物。神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)通過催化產(chǎn)生一氧化氮(NO)在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5]，nNOS的活性與其羧基末端PDZ配體(CAPON)密切相關(guān)，CAPON可減少NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，限制NO的產(chǎn)生，參與了nNOS引起的病理生理改變[6]。故本研究擬通過觀測氯胺酮聯(lián)合氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用，探討其對抑郁大鼠前額葉nNOS及其配體CAPON表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動物SPF級成年♂Sprague-Dawley(SD)大鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，批號SYXK(渝)2010-0002。

1.2 主要材料與試劑氯胺酮(批號101221，福建古田制藥廠)；氟西汀(批號：7052069，禮來蘇州制藥)；過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒(SP-9001，美國ZYMED公司)；DAB顯色劑(ZLI-9018，北京中杉金橋)；抗nNOS抗體(美國Cell Si gnaling Technology公司)；抗CAPON抗體(美國Santa Cruz公司)；TRIzol試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器曠場行為追蹤系統(tǒng)(ZH-ZFT型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；顯微鏡(BX51型，日本Olympus公司)；圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0，美國Media Cybernetics公司)。

2 方法

2.1 倫理學(xué)本實(shí)驗(yàn)獲得了重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的批準(zhǔn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理健康成年♂SPF級SD大鼠，體質(zhì)量220～270 g，2.5～3月齡。實(shí)驗(yàn)前全部動物均進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，并保持飼養(yǎng)室內(nèi)安靜，溫度22℃左右，濕度55%～65%和12 h/12 h明暗交替。參照文獻(xiàn)[7]制備慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)模型。每天隨機(jī)給予一種刺激(連續(xù)束縛2 h；明暗顛倒24 h；鼠籠傾斜24 h；潮濕墊料24 h；禁飲24 h；禁食24 h；4 ℃冰水游泳5 min；45熱應(yīng)激5 min；每分鐘搖晃1次，持續(xù)15 min；夾尾1 min)，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)28 d。建模后經(jīng)行為學(xué)測試(曠場實(shí)驗(yàn)及糖水偏好實(shí)驗(yàn))評估，較建模前下降30%以上的大鼠選為抑郁大鼠模型。

取抑郁模型建立成功的大鼠96只，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其隨機(jī)分為4組(n=24)：抑郁對照組(D組)、氯胺酮組(K組)、氟西汀組(F組)及氯胺酮聯(lián)合氟西汀組(KF組)。再根據(jù)給予藥物處理時間的不同，各組隨機(jī)分為2亞組(n=12)：處理3 d組(D3、K3、F3、KF3)和處理7 d組(D7、K7、F7、KF7)。K組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予生理鹽水10 ml·kg-1灌胃；F組生理鹽水10 ml·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1配制生理鹽水混懸液10 ml·kg-1灌胃后；KF組氯胺酮10 mg·kg-1腹腔注射后，即刻給予氟西汀1.8 mg·kg-1配制生理鹽水混懸液10 ml·kg-1灌胃；D組生理鹽水10 ml·kg-1腹腔注射，即刻給予生理鹽水10 ml·kg-1灌胃。各組每天處理1次，根據(jù)所在亞組組別連續(xù)3 d或7 d。

2.3 行為學(xué)測試采用曠場測試和糖水偏好實(shí)驗(yàn)評價其抑郁狀態(tài)。 分別于建模前1 d，建模后1 d及處理結(jié)束后1 d，參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行曠場測試和糖水偏好實(shí)驗(yàn)。選擇上午9 ∶00～12 ∶00于安靜的房間內(nèi)進(jìn)行觀察。曠場測試：使用曠場行為追蹤系統(tǒng)進(jìn)行測試，將大鼠放于曠場箱中央，計(jì)算3 min內(nèi)大鼠水平運(yùn)動距離及直立次數(shù)。每只大鼠測試完畢均徹底清潔，用酒精擦拭曠場箱后再進(jìn)行下一只的測試。糖水偏好實(shí)驗(yàn)前先訓(xùn)練大鼠適應(yīng)糖水(24 h內(nèi)同時給予兩瓶1%蔗糖水，500 ml/瓶)，測試前禁食禁水23 h，隨后每籠放入純水和1%蔗糖水各1瓶(500 ml/瓶)，1 h后分別測量糖水和純水的消耗量，計(jì)算糖水偏好比(糖水偏好比/%=糖水消耗量÷總液體消耗量×100%)。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測nNOS蛋白及其配體CAPON蛋白的表達(dá)于所有行為學(xué)檢測完成后1 d，各組隨機(jī)選擇6只大鼠，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，以4%多聚甲醛經(jīng)升主動脈灌注內(nèi)固定，斷頭取腦，切取大鼠前額葉腦組織。常規(guī)石蠟包埋、切片、片厚5 μm。nNOS蛋白的檢測：使用SP-9001過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。常規(guī)二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，熱抗原修復(fù)20 min，3%H2O2去離子水室溫孵育15 min，山羊封閉血清，室溫孵育30 min后滴加一抗nNOS(1 ∶50)，4℃冰箱中保存過夜，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗工作液，37℃孵育30 min，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min，以DAB顯色(除滴加山羊血清封閉液外，每步反應(yīng)前均用PBS沖洗3次×5 min)。陰性對照組用PBS液代替一抗孵育，其余步驟相同。顯色后烘干，二甲苯透明后封片。CAPON蛋白的檢測方法同nNOS蛋白，不同點(diǎn)在于一抗選用CAPON(1 ∶100)，每步反應(yīng)前的沖洗使用TBS代替PBS。每組大鼠隨機(jī)選擇5張切片，每張選取5個視野，顯微鏡下觀察，以Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析前額葉陽性表達(dá)區(qū)的光密度值，以反映nNOS蛋白及其配體CAPON蛋白表達(dá)。

2.5 RT-PCR檢測nNOS mRNA及其配體CAPON mRNA的表達(dá)各組剩余的6只大鼠，麻醉下快速斷頭，在去焦碳酸二乙醋水成的冰面上利用滅酶器械迅速分離前額葉，液氮凍存?？俁NA按TRIzol試劑盒說明書的步驟提取。每組取4 μg總RNA采用二步法進(jìn)行反應(yīng)。第1步為cDNA的合成，參照逆轉(zhuǎn)錄酶M-Mulv Reverse Transciptase使用說明書的步驟進(jìn)行，第2步為PCR擴(kuò)增。參照GenBank 公布的nNOS、CAPON及內(nèi)參β-actin序列，設(shè)計(jì)nNOS上游引物為5′-TGAAAGCACCAGCACCTACCAG-3′，下游引物5′-GGCACAATCCACACCCAGTC-3′ (擴(kuò)增產(chǎn)物879 bp)；CAPON上游引物為5′-GATGCCTGACTCTCGGAACTT-3′，下游引物5′-CAGCCGAGGATAACCAGCCGAT-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物144 bp)；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(擴(kuò)增產(chǎn)物540 bp)。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸1 min,30個循環(huán)后，72℃補(bǔ)充延伸5 min。取4 μl產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照并保存。通過Quantity One圖像分析軟件對電泳條帶進(jìn)行半定量分析，nNOS mRNA 及其配體CAPON mRNA分別和β-actin mRNA的光密度比值代表其各自的相對表達(dá)水平，重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠曠場試驗(yàn)結(jié)果與建模前比較，建模后大鼠水平運(yùn)動距離及直立次數(shù)減少(P<0.05)。各組大鼠建模后水平運(yùn)動距離和直立次數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在給予藥物干預(yù)3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組水平運(yùn)動距離及直立次數(shù)增多(P<0.05)。在給予藥物干預(yù)7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組水平運(yùn)動距離及直立次數(shù)增多(P<0.05)；與F7組比較，KF7組水平運(yùn)動距離及直立次數(shù)增多(P<0.05)。見Tab 1、2。

Tab 1 Comparison of distance and rearing number before andafter model in CUMS depressed ±s，n=96)

*P<0.05vspre-model

GroupPost-modelDistance/cmRearingnumberPost-treatmentDistance/cmRearingnumberD3291±734.3±1.9297±1084.1±2.2K3286±1033.5±1.1476±92#7.6±3.1#F3301±993.9±1.4304±774.0±1.3KF3276±844.1±0.9491±103#7.9±2.3#D7311±893.8±1.1317±913.9±1.9K7277±934.0±2.1504±107*9.1±2.4*F7294±773.7±1.3476±92*8.2±1.7*KF7303±943.2±1.8607±96*△11.3±3.3*△

#P<0.05vsgroup D3；*P<0.05vsgroup D7；△P<0.05vsgroup F7

3.2 各組大鼠糖水消耗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與建模前比較，建模后大鼠糖水偏好比降低(P<0.05)。各組建模前糖水偏好比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在給予藥物干預(yù)3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組糖水偏好比升高(P<0.05)。在給予藥物干預(yù)7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組糖水偏好比升高(P<0.05)；與F7組比較，KF7組糖水偏好比升高(P<0.05)。見Tab 3、4。

Pre-modelPost-modelSPP83.9±2.253.4±1.7*

*P<0.05vspre-model

GroupPost-modelPost-treatmentD354.5±2.757.3±2.9K352.7±2.670.9±2.3#F353.9±1.859.2±2.4KF351.3±2.169.9±1.8#D753.9±1.956.4±1.9K749.5±1.173.6±2.2*F748.8±2.469.3±2.9*KF751.7±3.179.6±2.0*△

#P<0.05vsgroup D3;*P<0.05vsgroup D7;△P<0.05vsgroup F7

3.3 各組大鼠前額葉nNOS蛋白、CAPON蛋白及其mRNA表達(dá)的比較在給予藥物干預(yù)3 d后，與D3組比較，K3組及KF3組CAPON 蛋白及其mRNA表達(dá)增加，nNOS蛋白及其mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在給予藥物干預(yù)7 d后，與D7組比較，K7組、F7組及KF7組CAPON蛋白及其 mRNA表達(dá)增加，nNOS蛋白及其mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與F7組比較，KF7組CAPON蛋白及其mRNA表達(dá)增加，nNOS 蛋白及其mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Tab 5，F(xiàn)ig 1、2、3。

Fig 1 Expressions of nNOS and CAPON mRNA in prefrontal lobe of rats in each group (RT-PCR)

Fig 2 Expression of nNOS in prefrontal lobe of rats (SP×400). The nNOS protein is mainly expressed in cytoplasm, marrow position is target protein. The nucleus for hematoxylin staining appear blue.

Fig 3 Expression of CAPON in prefrontal lobe of rats (SP×400). The CAPON protein is mainly expressed in cytoplasm, marrow position is target protein. The nucleus for hematoxylin staining appear blue.

Tab 5 Expressions of nNOS, CAPON protein and mRNA inprefrontal lobe of rats in each ±s,n=6)

#P<0.05vsgroup D3;*P<0.05vsgroup D7;△P<0.05vsgroup F7

4 討論

CUMS是目前抑郁癥機(jī)制研究中應(yīng)用最廣泛的抑郁模型，能夠有效的模擬人類環(huán)境應(yīng)激所導(dǎo)致的抑郁癥狀[7,9]，并已成功應(yīng)用于本課題組前期研究中[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS方法建模后抑郁大鼠的行為學(xué)指標(biāo)均低于建模前，表明建模后大鼠快感缺失，對新環(huán)境探索能力和興奮程度下降，這與臨床上抑郁癥狀精神運(yùn)動抑制、快感缺失等相符合，說明抑郁模型的建立是成功的。

本研究參照文獻(xiàn)[12]，腹腔注射10 mg·kg-1氯胺酮，結(jié)果表明，與建模前及抑郁組比較，K組大鼠快感消失、對新環(huán)境探索能力和興奮程度的表現(xiàn)得到改善，提示氯胺酮具有明顯的抗抑郁作用，這與既往研究結(jié)果一致[3-4]。研究中為保證給藥量的準(zhǔn)確，將氟西汀在生理鹽水中加熱溶解，按比例(1.8 mg氟西汀 ∶10 ml生理鹽水)配制成混懸液，參照既往研究以1.8 mg·kg-1進(jìn)行灌胃[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)對于CUMS抑郁模型建立成功的大鼠，經(jīng)氯胺酮聯(lián)合氟西汀處理3 d后，其曠場實(shí)驗(yàn)評分、糖水偏好比相對于抑郁模型組及單純使用氟西汀組明顯增加。而此時使用了氟西汀的大鼠與抑郁組大鼠相比無明顯差異。前期動物實(shí)驗(yàn)顯示，氟西汀需5～7 d方能起效，這與本研究結(jié)果一致。在給藥7 d后，氯胺酮聯(lián)合氟西汀組，其曠場實(shí)驗(yàn)評分、糖水偏好比相對于單純使用氟西汀組明顯增加，提示氯胺酮聯(lián)合氟西汀較單獨(dú)使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強(qiáng)，抗抑郁起效時間縮短。

本實(shí)驗(yàn)取材選取與抑郁癥關(guān)系最為密切的大腦前額葉進(jìn)行分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于CUMS抑郁模型建立成功的大鼠，經(jīng)氯胺酮聯(lián)合氟西汀處理后，相對于抑郁模型組及單純使用氟西汀組，抑郁行為得到改善，前額葉nNOS蛋白及mRNA水平明顯降低，其配體CAPON蛋白及mRNA水平明顯升高。提示氯胺酮聯(lián)合氟西汀可能通過促進(jìn)抑郁大鼠前額葉神經(jīng)元CAPON的表達(dá)，進(jìn)而抑制nNOS活性來改善大鼠的抑郁狀態(tài)。nNOS是一種主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)的酶類，可以催化L-精氨酸形成NO，而NO作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的信使分子和神經(jīng)遞質(zhì)在抑郁癥的發(fā)病中起著重要作用。生理量的NO對神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，但過量的NO卻會引起神經(jīng)毒性作用[7]。當(dāng) NO過度增加可誘發(fā)其生成的正反饋環(huán)路激活，進(jìn)而線粒體損傷，ATP等能量生成減少，隨之出現(xiàn)細(xì)胞的損傷及凋亡，嚴(yán)重影響細(xì)胞的功能。前期多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，NO的神經(jīng)毒性作用參與了抑郁癥、阿爾茨海默病、帕金森病以及亨廷癥的病理生理過程。既往研究發(fā)現(xiàn)[14]，抑郁癥患者血清中存在NO水平升高及NOS活力升高。

NO屬于氣體分子，在細(xì)胞中存留時間短(僅2～5 s)，不易準(zhǔn)確檢測，故本次研究選用神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)進(jìn)行檢測，從而反映細(xì)胞內(nèi)NO的濃度。本次研究發(fā)現(xiàn)，抑郁大鼠在經(jīng)氯胺酮及氟西汀治療后，抑郁行為明顯改善，大鼠腦內(nèi)前額葉nNOS蛋白及mRNA表達(dá)明顯減低，提示大鼠抑郁時所出現(xiàn)的NO合成過量受到了抑制。CAPON是nNOS的一種接頭調(diào)控蛋白，可與PSD95競爭性結(jié)合nNOS，抑制NMDAR對nNOS的激活，減少NO的合成和釋放，從而減少nNOS過度激活產(chǎn)生大量NO而引起的生理或病理作用[15]。

綜上所述，氯胺酮聯(lián)合氟西汀較單獨(dú)使用氟西汀對抑郁大鼠的抗抑郁作用更強(qiáng)，且抗抑郁起效時間縮短。其機(jī)制可能與氯胺酮聯(lián)合氟西汀能通過促進(jìn)抑郁大鼠前額葉神經(jīng)元CAPON的表達(dá)，進(jìn)而抑制nNOS活性來改善大鼠的抑郁狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)為臨床抑郁癥急性發(fā)作的治療提供方向。

[1] 劉佳莉, 苑玉和, 陳乃宏, 等. 抑郁癥的治療研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2011,27(9):1193-6.

[1] Liu J L, Wan Y H, Chen N H, et al. Research progress in treatment of depression[J].ChinPharmacolBull,2011,27(9):1193-6.

[2] 薛 瑞, 張有志, 鄒莉波. 快速起效抗抑郁藥物的研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(12):1558-61.

[2] Xue R,Zhang Y Z,Zou L B. Progress in the development of early-onset antidepressants[J].ChinPharmacolBull,2008,24(12):1558-61.

[3] Ibrahim L, Diazgranados N, Luckenbaugh D A, et al. Rapid decrease in depressive symptoms with an N-methyl-d-aspartate antagonist in ECT-resistant major depression[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry, 2011,35(4): 1155-9.

[4] Murrough J W, Charney D S. Cracking the moody brain: lifting the mood with ketamine[J].NatMed, 2010,16(12): 1384-5.

[5] Keilhoff G, Fansa H, Wolf G. Nitric oxide synthase, an essential factor in peripheral nerve regeneration[J].CellMolBiol, 2003,49(6):885-97.

[6] Jaffrey S R, Snowman A M, Eliasson M J, et al. CAPON:a protein associated with neuronal nitric oxide synthase that regulates its interactions with PSD95[J].Neuron, 1998,20(1):115-24.

[7] Banasr M, Valentine G W, Li X Y, et al. Chronic unpredictable stress decreases cell proliferation in the cerebral cortex of the adult rat[J].BiolPsychiatry,2007,62(5):496-504.

[8] Luo K R, Hong C J, Liou Y J, et al. Differrent regulation of neurotrophin S100B and BDNF in two rat models of depression[J].ProgNeuropsrchopharmacolBiolPsychiatry, 2010,34(8):1433-9.

[9] Banasr M, Chowdhury G M, Terwilliger R, et al. Glial pathology in an animal model of depression: reversal of stress-induced cellular, metabolic and behavioral deficits by the glutamate-modulating drug riluzole[J].MolPsychiatry, 2010,15(5):501-11.

[10] Li W, Liu L, Liu Y Y, et al. Effects of electroconvulsive stimulation on long-term potentiation and synaptophysin in the hippocampus of rats with depressive behaxior[J].JECT,2012,28(2):111-7.

[11] 李 煒, 閔 蘇, 李 曉, 等. 小劑量氯胺酮對抑郁大鼠異丙酚麻醉下電休克療效的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2011,31(6):680-3.

[11] Li W, Min S,Li X, et al.Effect of low-dose ketamine on efficacy of electroconvulsive therapy under propofol anesthesia in depressed rats[J].ChinJAnesthesiol, 2011,31(6):680-3.

[12] 楊 春, 李文媛, 張廣芬, 等. 不同劑量氯胺酮對抑郁大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和酪氨酸受體激酶B的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志, 2011,31(4):460-2.

[12] Yang C, Li W Y, Zhang G F, et al.Effects of different doses of ketamine on brain-derived neurotrophic factor and tyrosine receptor kinase B in hippocampus in mentally depressed rats[J].ChinJAnesthesiol, 2011,31(4):460-2.

[13] 李衛(wèi)東,吳元坪,韓止榮,等.電針及氟西汀對抑郁大鼠行為學(xué)及海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J].中華精神科雜志,2008,41(4):237-40.

[13] Li W D, Wu Y P, Han Z R, et al.Effects of electroacupuncture and fluoxitine on behavior and apoptosis of hippocampal cells in chronic stress rat[J].ChinJPsychiatry, 2008,41(4):237-40.

[14] Zhang J, Xu H M, Zhang C Y, et al.The relationship between nitric oxide synthase activity and depression[J].NeurosciBull,2005,21(6):404-7.

[15] Cui Z M, Lü Q S, Yan M J, et al. Elevated expression of CAPON and neuronal nitric oxide synthase in the sciatic nerve of rats following constriction injury[J].VeterinaryJ,2011,187:374-80.

Effects of ketamine plus fluoxetine on nNOS and CAPON expression in the prefrontal lobe of mentally depressed rats

SHEN Yi-wei, LYu Feng, LI Ping, LUO Jie, XIE Fei, MIN Su

(DeptofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Aim To investigate the effect of ketamine plus fluoxetine on depressed behavior and the expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and CAPON in prefrontal lobe of mentally depressed rats at different time points,so as to study the possible mechanism of ketamine plus fluoxetine inducing antidepressant behavior. Methods Healthy adult male Sprague-Dawley rats, aged 2.5～3 months, weighing 220～270 g, were induced as the rodent model of depression by chronic unpredictable mild stress (CUMS). After the models of depression were established, 96 of CUMS modeling successfully depressed rats were selected. Then they were randomly divided into four groups (n=24 each): the depressed group (group D, untreated group), ketamine group (group K, treated with intraperitoneal injection of ketamine 10 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days), fluoxetine group (group F, treated with gavage of fluoxetine 1.8 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days), or ketamine plus fluoxetine group (group KF, treated with intraperitoneal injection of ketamine 10 mg·kg-1plus gavage of fluoxetine 1.8 mg·kg-1once a day for 3 days or 7 days). Open field test and sucrose preference test were performed 1 day before depression model was established, and 1 day before and after treatment. The rats were sacrificed 1 day after the last test for determination of the expression of nNOS and CAPON protein (using immuno-histochemisity) and mRNA (by RT-PCR) in the prefrontal lobe. Results After the models of depression were established, the total distance, rearing number and the sucrose preference percentage (SPP) were decreased significantly compared with those before (P<0.05).There was no significant difference among all groups in the total distance, rearing number and the SPP before treatment (P>0.05). Compared with groups D and F, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in groups K and KF, with 3 days’ treatment (P<0.05). Compared with group D, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in groups K,F and KF with 7 days’ treatment (P<0.05). Compared with group F, the total distance was prolonged, the number of rearing and SPP were significantly increased, the expression of nNOS protein and mRNA was down-regulated and the expression of CAPON protein and mRNA was up-regulated in group KF with 7 days’ treatment (P<0.05). Conclusion Co-administration of antidepressant fluoxetine with ketamine may induce a more pronounced antidepressant activity than treatment with each antidepressant alone and it can shorten the time to improve the depressive state through promoting the expression of CAPON and inhibiting nNOS activity in the prefrontal lobe of mentally depressed rats.

ketamine; fluoxetine; depression; prefrontal lobe; nitirc oxide synthase; CAPON

時間：2015-3-16 15:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.018.html

2014-12-06,

2015-02-19

國家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(No 30972831, 81271501)；重慶市教育委員會科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No KJ090309)；重慶市醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(No 2007-02)；衛(wèi)生部國家臨床重點(diǎn)學(xué)科(No 2011-170)

沈一維(1985-) 女，碩士，醫(yī)師，研究方向：抑郁癥與認(rèn)知功能，E-mail:yiwei1928@126.com； 閔 蘇(1960-) 女，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：抑郁癥與認(rèn)知功能、圍術(shù)期內(nèi)重要臟器保護(hù)，通訊作者，Tel：023-89011068，E-mail: ms89011068@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.010

A

1001-1978(2015)04-0487-06

R-332；R322.81； R749.42；R971.2；R971.4；R977.3