榮骨定痛膏的鎮(zhèn)痛抗炎作用及其機(jī)制*

劉曉霞， 王志旺△， 陳小平， 劉彩民， 妥海燕

(1． 甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000; 2． 甘肅省靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院，靖遠(yuǎn) 730600)

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榮骨定痛膏的鎮(zhèn)痛抗炎作用及其機(jī)制*

劉曉霞1， 王志旺1△， 陳小平2△， 劉彩民2， 妥海燕1

(1． 甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000; 2． 甘肅省靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院，靖遠(yuǎn) 730600)

目的：研究榮骨定痛膏鎮(zhèn)痛、抗炎作用及其機(jī)制。方法：采用熱板法、醋酸扭體法來(lái)觀測(cè)榮骨定痛膏的鎮(zhèn)痛作用，采用耳廓腫脹法、足腫脹法來(lái)考察榮骨定痛膏的抗炎作用，測(cè)定滲出液中總蛋白與白三烯B4(LTB4)來(lái)研究榮骨定痛膏的抗炎機(jī)制。在給藥的基礎(chǔ)上觀測(cè)痛閾值、腫脹度等指標(biāo)；復(fù)制氣囊滑膜炎，取小鼠66只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(扶他林0.8 mg/d)、榮骨定痛膏低、中、高劑量組(榮骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d的榮骨定痛膏可明顯提高小鼠熱板痛閾延長(zhǎng)百分率、延長(zhǎng)扭體潛伏期并減少15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，緩解小鼠耳廓腫脹度與足腫脹度(P<0.05,P<0.01)，顯示出一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。對(duì)氣囊滑膜炎模型動(dòng)物，30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d榮骨定痛膏可降低滲出物中總蛋白及LTB4的含量(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論：榮骨定痛膏具有一定的鎮(zhèn)痛抗炎作用，抑制LTB4的合成是其抗炎機(jī)制之一。

榮骨定痛膏；鎮(zhèn)痛；抗炎；白三烯B4；小鼠

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，屬于老年臨床常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量。臨床上常用解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥等藥物來(lái)緩解疼痛癥狀，而激素雖然療效好，但長(zhǎng)期使用存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，目前尚缺乏安全有效的治療措施；在緩解疼痛、改善關(guān)節(jié)功能等方面，作為非手術(shù)療法的中醫(yī)藥日益受到人們的重視[1]。骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”的范疇，多因腎氣虧虛、關(guān)

節(jié)失養(yǎng)，復(fù)受風(fēng)寒濕邪，氣血痹阻，經(jīng)絡(luò)不暢所致，治則應(yīng)補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛?；谏鲜鲋嗅t(yī)藥理論指導(dǎo)下形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好的療效。本次研究設(shè)計(jì)了熱板法、扭體法、耳廓腫脹法、足腫脹法以及氣囊滑膜炎動(dòng)物模型，觀察榮骨定痛膏鎮(zhèn)痛抗炎作用1及對(duì)炎癥介質(zhì)的影響，探討榮骨定痛膏的鎮(zhèn)痛抗炎作用及其機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

榮骨定痛膏，由甘肅省靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院提供，批號(hào)：20140415。扶他林乳膠劑(Voltaren gel)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：每支20 g乳膠劑中含雙氯酚酸二乙胺0.2 g(以雙氯酚酸鈉計(jì))。白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)、考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒，上海瑞齊生物科技有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：20140601、20140605；醋酸、甲醛、二甲苯等試劑為分析純。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠，雌雄兼用，體重18～22 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001。

1.3 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市正基儀器有限公司生產(chǎn)；TGL-16G高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；BS1103型Sartorius電子天平，北京賽多利斯天平有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 小鼠熱板致痛的測(cè)定 將雌性小鼠放于55℃±0.5℃的恒溫?zé)岚迳希詮姆庞跓岚逯系教蚝笞愕臅r(shí)間為痛閾值，選取痛閾值在5～30 s的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取55只小鼠按體重隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(扶他林0.8 mg/d)、榮骨定痛膏低、中、高劑量組(榮骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)，于雙后足涂抹40 μl高、中、低濃度榮骨定痛膏或扶他林，正常對(duì)照組涂抹等量生理鹽水，6 h后再給藥1次，共給藥2次，末次給藥后測(cè)定30、60、90 min小鼠的痛閾值。若60 s仍無(wú)反應(yīng)者應(yīng)立即將小鼠取出并按60 s計(jì)算。

1.4.2 醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的測(cè)定 取55只小鼠，按性別體重分層隨機(jī)分為5組(n=11)：即正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(扶他林0.8 mg/d)、榮骨定痛膏低、中、高劑量組(榮骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)。小鼠腹部脫毛(3 cm×3 cm)，在脫毛區(qū)涂抹40 μl高、中、低濃度榮骨定痛膏或扶他林，正常對(duì)照組涂抹等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。末次涂藥1.5 h后，各組小鼠分別ip 0.7%醋酸溶液0.2 ml，觀察小鼠扭體潛伏期(從注射醋酸到出現(xiàn)第1次扭體的時(shí)間)及15 min內(nèi)出現(xiàn)的扭體次數(shù)。

1.4.3 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的測(cè)定 動(dòng)物分組及給藥劑量同1.4.2項(xiàng)下。各組分別于右耳廓兩側(cè)涂抹40 μl高、中、低濃度榮骨定痛膏藥液或扶他林，正常對(duì)照組涂抹等量生理鹽水。給藥后1 h于每鼠右耳兩側(cè)均勻涂抹二甲苯50 μl致炎，30 min后處死動(dòng)物，用直徑8 mm的打孔器于小鼠兩耳相同部位打下耳片，稱重，計(jì)算小鼠耳腫脹度。

1.4.4 甲醛所致小鼠足腫脹的測(cè)定[2, 3]動(dòng)物、分組及給藥劑量同1.4.2。各組分別在右足趾涂抹40 μl高、中、低濃度榮骨定痛膏藥液或扶他林，正常對(duì)照組涂抹等量生理鹽水，6 h后再給藥1次，共給藥2次。給藥后于每鼠右后足足墊皮下注射5%甲醛15 μl，致炎4 h后處死動(dòng)物，在小鼠后足同一部位處剪下左右后足，稱重，計(jì)算小鼠足腫脹度。

1.4.5 小鼠氣囊滑膜炎滲出物中蛋白及LTB4的測(cè)定[4]將雄性小鼠背部脫毛(3 cm×3 cm)，脫毛區(qū)下方sc過(guò)濾空氣10 ml，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天補(bǔ)充注射空氣，使小鼠背部脫毛區(qū)下方的氣囊維持在第1次注射后的大小。第3天小鼠按體重分層隨機(jī)分為6組(n=11)：即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(扶他林0.8 mg/d)、榮骨定痛膏低、中、高劑量組(榮骨定痛膏30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d)。在脫毛區(qū)涂抹40 μl高、中、低濃度榮骨定痛膏或扶他林，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組涂抹等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。第4天給藥后每只小鼠背部氣囊注射含1%甲醛的生理鹽水0.2 ml，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。致炎24 h，末次涂藥3 h后，用2%戊巴比妥鈉ip麻醉小鼠，取Hank's液1 ml灌洗氣囊，3 000 r/min離心灌洗液10 min，取上清液按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定滲出液中總蛋白與LTB4的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 榮骨定痛膏對(duì)小鼠熱板致痛的影響

榮骨定痛膏低、中、高劑量組能明顯延長(zhǎng)小鼠熱板痛閾延長(zhǎng)百分率，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表1)；與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏高劑量組在60 min、90 min的痛閾延長(zhǎng)百分率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，顯示出一定的量效關(guān)系。

2.2 榮骨定痛膏對(duì)醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的影響

榮骨定痛膏低、中、高劑量組小鼠的扭體潛伏期明顯延長(zhǎng)、15 min內(nèi)的扭體次數(shù)明顯減少，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)；同時(shí)，與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏中、高劑量組的鎮(zhèn)痛作用更強(qiáng)(P<0.05,P<0.01,表1)，顯示出一定的量效關(guān)系。

Tab. 1 Analgesic effect of RGDT Plaster on hot plate test and acetic acid writhing in mice ±s, n=11)

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vslow dose of RGDT plaster

2.3 榮骨定痛膏對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，榮骨定痛膏低、中、高劑量組可明顯緩解二甲苯所致小鼠耳廓腫脹程度，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

2.4 榮骨定痛膏對(duì)甲醛所致小鼠足腫脹的影響

榮骨定痛膏低、中、高劑量組小鼠足腫脹度明顯降低，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Anti-inflammatory effect of RGDT plaster on auricle and food swelling in mice ±s, n=11)

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster

**P<0.01vscontrol group

2.5 榮骨定痛膏對(duì)小鼠氣囊滑膜炎滲出物中總蛋白及LTB4的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠背部氣囊注射甲醛后，滲出物中的總蛋白及其中LTB4的含量顯著升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)。經(jīng)榮骨定痛膏干預(yù)后，總蛋白及LTB4的含量明顯下降，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，30～120 mg/d的榮骨定痛膏對(duì)滲出物中總蛋白及LTB4的影響有一定的量效關(guān)系。

GroupDose(mg/d)Totalprotein(mg/mL)LTB4(ng/mL)Control-3.18±0.7620.04±3.08Model-10.83±1.65**100.97±15.46**Voltarengel0.86.61±1.01##103.54±16.44Low308.69±1.35##83.10±13.36##Middle607.14±1.16##△△72.16±12.39##High1206.35±0.96##△△62.05±10.38##△△

RGDT plaster: Ronggudingtong plaster; LTB4: Leukotriene B4

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vslow dose of RGDT plaster

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)也稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎等，好發(fā)于膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、脊柱及手指等部位，是一種多發(fā)于老年人的慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病。隨著社會(huì)進(jìn)入老齡化，該病發(fā)病率逐年增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美、英等西歐國(guó)家有5%～10%的成年人患有膝關(guān)節(jié)炎，此病與心血管疾病、創(chuàng)傷并列前三位，每年需手術(shù)治療者達(dá)幾十萬(wàn)人，由此產(chǎn)生的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有很大影響[5]；隨著我國(guó)社會(huì)人口結(jié)構(gòu)的迅速老齡化，本病不僅是公共衛(wèi)生問(wèn)題，而且也成為社會(huì)問(wèn)題，日益引起人們的重視。因此，防治OA已成為各國(guó)骨科學(xué)界的重要課題。OA的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但其基本病理變化為關(guān)節(jié)軟骨的退行性變與關(guān)節(jié)的增生性改變(特別是軟骨周圍及滑膜處)。目前臨床上尚缺乏有效的根治措施，治療的目的是緩解關(guān)節(jié)疼痛，改善功能并促進(jìn)重建受損的軟骨及骨結(jié)構(gòu)；由于手術(shù)治療缺乏確切有效的臨床治療方案，使得病程明顯延長(zhǎng)；作為非手術(shù)療法的中醫(yī)中藥日益受到人們的重視[6]。骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，OA多因年老腎氣虧虛，關(guān)節(jié)失養(yǎng)，局部勞損癖阻；復(fù)受風(fēng)寒濕邪，經(jīng)絡(luò)不暢，氣血痹阻，關(guān)節(jié)寒凝、痰阻，不通則痛，故治療應(yīng)補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)、祛風(fēng)散寒、勝濕止痛。在此基礎(chǔ)上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當(dāng)歸、秦艽、獨(dú)活、川烏等四十余味中草藥組成，在靖遠(yuǎn)縣中醫(yī)院臨床使用取得了比較好的療效。

本次研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)考察榮骨定痛膏的鎮(zhèn)痛、抗炎作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，榮骨定痛膏可明顯提高小鼠熱板痛閾延長(zhǎng)百分率，延長(zhǎng)扭體潛伏期、減少15 min內(nèi)的扭體次數(shù)，提示榮骨定痛膏具有確切的鎮(zhèn)痛作用；實(shí)驗(yàn)顯示榮骨定痛膏可明顯緩解二甲苯所致小鼠耳廓腫脹與甲醛所致足腫脹，提示榮骨定痛膏具有確切的抗炎作用。炎癥是炎癥介質(zhì)引起的局部紅、腫、熱、痛并伴有全身反應(yīng)的綜合癥，白三烯(leukotrienes, LTS)是花生四烯酸在5-脂氧合酶催化下生成的常見(jiàn)炎癥介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)、白三烯C4(LTC4)與白三烯D4(LTD4)等[7, 8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，榮骨定痛膏可降低小鼠氣囊滑膜炎性滲出物中總蛋白及LTB4的含量，提示抑制炎癥介質(zhì)LTB4的合成是榮骨定痛膏抗炎的機(jī)制之一。

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The antalgic and antiphlogistic function and mechanism of RGDT plaster

LIU Xiao-xia1， WANG Zhi-wang1△， CHEN Xiao-ping2△， LIU Cai-min2， TUO Hai-yan1

(1. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Traditional Chinese Medicine Hospital of Jingyuan Country in Gansu Province, Jingyuan 730600, China)

Objective: To study the antalgic and antiphlogistic functions and mechanism of ronggudingtong (RGDT) plaster(traditional Chinese medicine). Methods: The painful models were established with hot plate test or acetic acid writhing and the inflammatory models were established with daubing dimethylbenzene on auricle or injecting formaldehyde in toe or synovial envelope to study the antalgic and antiphlogistic functions of RGDT Plaster. The total protein and leukotriene B4(LTB4) in inflammatory exudate were detected to investigate the antalgic and antiphlogistic mechanism of RGDT plaster. The mice were randomly divided into different groups(n=11),on the basis of drug using，the indexes of pain threshold, swelling degree were observed. Sixty-six mice were used to establish gasbag synovitis model and randomly divided into normal control group，model control group，positive control group(Voltaren gel 0.8 mg/d)and low/medium/high dosage RGDT plaster treating groups(30 mg/d,60 mg/d, 120 mg/d). Results: 30 mg/d、60 mg/d、120 mg/d RGDT plaster could upgrade the pain thresholds, remit auricular and foot swelling(P<0.05,P<0.01), and degrade total protein and LTB4in inflammatory exudates(P<0.05,P<0.01). Conclusion: RGDT plaster has some antalgic and antiphlogistic functions, and one of the mechanisms is depressing synthesis of LTB4.

ronggudingtong plaster (RGDT plaster); analgesia; anti-inflammatory; LTB4; mice

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研課題基金項(xiàng)目(GZK-2013-38)

2015-01-23 【修回日期】2015-06-15

R285.5

A

1000-6834(2015)05-462-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.020

△【通訊作者】Tel: 0931-8765395； E-mail: wzw0933@126.com