柳葉亞菊中酚類化合物的抗氧化和抗腫瘤活性及凋亡機制*

張 偉， 巫洪儒， 梁乾坤， 李云霞， 盧研宇， 龍 瑤， 祝 英， 李紅芳,3△

(1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2. 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室， 3. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，4. 蘭州大學(xué)應(yīng)用有機化學(xué)國家重點實驗室， 甘肅蘭州730000)

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柳葉亞菊中酚類化合物的抗氧化和抗腫瘤活性及凋亡機制*

張 偉1,2， 巫洪儒4， 梁乾坤1， 李云霞1， 盧研宇2， 龍 瑤2， 祝 英4， 李紅芳1,2,3△

(1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室， 2. 甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室， 3. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，4. 蘭州大學(xué)應(yīng)用有機化學(xué)國家重點實驗室， 甘肅蘭州730000)

目的：從柳葉亞菊植物中提取的兩種具有顯著生物活性的天然苯酚類化合物4-羥基-3,5-二甲氧基-4-(2-丙酮基)環(huán)己烷-2,5-二烯-1-酮和6-甲氧基-5,7-二羥基香豆素(分別命名為Ⅰ號和Ⅱ號)，分析測定其抗氧化活性和抗腫瘤活性及其促凋亡機制。方法：采用DPPH和ABTS自由基法以及MTT法分別測定兩種化合物抗氧化和體外抗腫瘤活性，利用RT-PCR測定兩種化合物對人血癌細胞株K562細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB P65 mRNA的表達以及Western blot測定其對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB P65、Fas、β-catenin和E-cadherin四種蛋白表達的影響。結(jié)果：①抗氧化實驗分析得出Ⅰ號化合物具有強烈的抗氧化活性而Ⅱ號化合物無抗氧化活性；②抗腫瘤(MTT)實驗分析數(shù)據(jù)可知Ⅰ號化合物無抗腫瘤活性而Ⅱ號化合物具有強烈的抗腫瘤活性；③利用實時定量q-PCR測得加入Ⅱ號化合物組與空白組相比，NF-κB P65 mRNA的表達明顯上調(diào)(P<0.05)；④通過Western blot實驗得出Ⅱ號化合物組核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB P65、Fas、β-catenin和E-cadherin四種蛋白的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，并且蛋白表達量與藥物濃度呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：兩種酚類化合物分別具有抗氧化和抗腫瘤活性，Ⅱ號化合物的抑癌作用機理可能一方面通過上調(diào)NF-κB P65、Fas表達，進入經(jīng)典的Fas凋亡信號通路；另一方面，通過誘導(dǎo)β-catenin連環(huán)蛋白以及E-cadherin鈣粘蛋白的表達上調(diào)，二者參與細胞間的粘連，對防止癌細胞的擴散和腫瘤的轉(zhuǎn)移具有重大意義。

酚類化合物；抗氧化活性；抗腫瘤活性；核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65；Fas受體；β-連環(huán)蛋白；E-鈣粘蛋白

亞菊屬植物柳葉亞菊，主要分布在我國北部和西南部地區(qū)，具有清熱解毒、消炎止血等作用；柳葉亞菊植物所含化學(xué)成分復(fù)雜，主要有苯酚類、倍半萜類、三萜甾體類、苯丙素類黃酮類等。此外，還含有生物堿、多糖及一些脂肪酸等。苯酚類化合物是從柳葉亞菊植物中分離得到種類最多的化學(xué)成分之一，也是其最主要的有效成分。近年來，隨著分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等的發(fā)展，人們對中醫(yī)藥防治血癌作用機制的研究已上升到了基因、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等微觀水平。雖然許多研究已經(jīng)證實從柳葉亞菊中提取的酚類物質(zhì)具有抗氧化抗腫瘤活性，但是凋亡機制尚未明確[1]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB是一種多效可誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)多種基因的表達和細胞因子的產(chǎn)生，廣泛存在于真核細胞中，近來研究證實從柳葉亞菊中提取的酚類化合物能誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65的表達。本實驗應(yīng)用q-PCR、免疫組化和Western blot等方法觀察酚類化合物對核轉(zhuǎn)錄因子-κB P65和細胞凋亡的影響，進一步揭示酚類化合物誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制，從而為臨床治療提供確切的理論基礎(chǔ)[2]。

1 材料和方法

1.1 材料

從柳葉亞菊中提取的酚類化合物4-羥基-3,5-二甲氧基-4-(2-丙酮基)環(huán)己烷-2,5-二烯-1-酮和6-甲氧基-5,7-二羥基香豆素(Ⅰ和Ⅱ,蘭州大學(xué)天然有機國家重點實驗室提取)；人血癌細胞株K562細胞購置中科院上海細胞所；MTT、順鉑(ACROS ORCANICS)、5-Fluorouracil ≥99%購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基Thermo scientific產(chǎn)品；胎牛血清(HyClone)、胰蛋白酶(Hyclone)購自Thermo公司；DPPH，ABTS，BHA和Trolox購自Sigma-Aldrich公司；PCR引物由Intitrogen公司合成；Trizol RNA抽提試劑購置life公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購置于Promega公司；q-PCR試劑盒是Bestar Sybr Gree qPCR mastermix產(chǎn)品；NF-κB P65(A)、ZS-109兔抗人單克隆抗體和Fas抗體購置于北京中杉金橋；E-cadherin抗體、β-catenin和β-actin抗體購自于Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 兩種化合物對ABTS和DPPH兩種自由基抗氧化測定

待測樣品Ⅰ號和Ⅱ號的抗氧化活性通過清除2 ,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate, ABTS+)和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)自由基來測定，兩類化合物各100 μl的甲醇溶液分別與100 μl的ABTS+和DPPH溶液混合加入到96孔板；室溫避光環(huán)境下反應(yīng)0.5 h；然后分別在酶標(biāo)儀734 nm(ABTS+)和517 nm(DPPH)波長下測定OD值;配制同一樣品的5個不同濃度2.5～40 μg/ml；單純ABTS+和DPPH孔代表空白組；水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid,Trolox)和丁基羥基茴香醚(Butyl hydroxyanisd,BHA)作為陽性對照，甲醇的純?nèi)芤鹤鳛檎{(diào)零組[1]；設(shè)定5個濃度梯度3個復(fù)孔；捕捉效率的計算公式抑制率(%)=[A0-(At-B)]/A0×100% (t=6 min)。A0代表不加藥物的空白組；At代表加入梯度藥物與自由基反應(yīng)時間為6 min(ABTS+)和10 min(DPPH)；B代表甲醇純?nèi)芤旱恼{(diào)零組；IC50表示藥物清除自由基一半時所需的藥物濃度[1]。

1.3 MTT法測定兩種化合物的抗腫瘤活性

因為兩種化合物是脂溶性的，所以必須用二甲基亞楓(dimethyl sulfoxide, DMSO)助溶；工作液中加入的DMSO的濃度應(yīng)該小于終濃度的1%，K562細胞濃度為9×104cells/ml加入到96孔板里面，每個孔90 μl然后加入藥物10 μl；藥物設(shè)定5個濃度梯度5～80 μg/ml；孵育48 h，加入10 μl MTT(濃度5 mg/ml PBS溶解)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后加入三聯(lián)液100 μl(10% SDS 和0.01 mol/L HCl) 37℃過夜，用酶標(biāo)儀測定570 nm波長OD值； IC50表示藥物促凋亡一半時所需的藥物濃度。計算抑制率公式抑制率(%)=(未加藥的A570-加藥的A570)/未加藥的A570[3]。

1.4 實時定量PCR測定NF-κB P65 mRNA表達

Trizol試劑常規(guī)提取總RNA，經(jīng)核酸紫外分析儀檢測，根據(jù)A260/A280的比值確定了RNA樣品的純度(A260/280=1.9～2.0)和含量;提取的RNA的濃度最好是1 μg/μl；取1 μl每組細胞提取的RNA按照Promega試劑盒說明合成出cDNA；再取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR[4]，按照PCR試劑盒說明書一般擴增30～35個循環(huán)；β-actin做為內(nèi)參基因引物序列：上游5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3’,下游5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’,目的基因NF-κB P65引物序列上游5’-GGGGACTACGACCTGAATG-3’,下游5’-CGGGCACGATTGTCAAAGAT-3’,mRNA含量的計算：通過實時定量PCR計算出的Ct值，利用2-ΔΔCt法算出各組mRNA的相對含量。

1.5 免疫印跡法測定藥物干預(yù)后目的蛋白的表達

1.5.1 實驗分組及蛋白提取培養(yǎng)人血癌細胞株 K562細胞，設(shè)定一個不加藥的空白對照組和化合物Ⅰ號和Ⅱ號各三個濃度梯度組(5、10、20 μg/ml)；培養(yǎng)24 h后，提取蛋白；每瓶細胞加入RIPA裂解液300 μl裂解10 min，冰浴兩次(每次5 min)結(jié)束后漩渦混勻30 s，4℃離心(12 000×g，10 min)，上清移至新的EP管中，蛋白提取完畢；凍存與-70℃冰箱備用[4]。

1.5.2 配膠和電泳 (1)配置10%分離膠和5%的濃縮膠：取要上樣的蛋白樣品30 μg/well；提取的蛋白按照5∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性5 min，取出后立即放置于冰上(防止蛋白復(fù)性)，然后用SDS-PAGE垂直凝膠電泳分離不同分子量蛋白質(zhì)，濃縮膠10 mA 20 min，分離膠15 mA 60 min，當(dāng)溴酚藍條帶至凝膠底部時，停止電泳。

1.5.3 轉(zhuǎn)膜 用半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜進行免疫印跡，其中I抗為β-actin、NF-κB P65、FAS、E-cadherin和β-catenin兔抗人單克隆抗體，稀釋濃度為1∶1 000，II抗為辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔IgG，稀釋濃度為1∶10 000；增強化學(xué)發(fā)光法，X片放射自顯影，掃描，最后用凝膠圖像分析軟件Gelpro32測定灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ號Ⅱ號化合物對DPPH和ABTS自由基的清除活性

Trolox作為ABTS自由基的陽性對照而BHA作為DPPH自由基的陽性對照，Ⅰ號化合物和Ⅱ號化合物作為實驗組，ABTS和DPPH作為兩種藥物的作用底物；加藥后48 h的作用結(jié)果可知：Ⅰ號化合物對DPPH的IC50值為1.99 μg/ml，對ABTS自由基的IC50值為1.49 μg/ml和Ⅱ號化合物對ABTS和DPPH兩種自由基的IC50值>40 μg/ml差異有顯著性(P<0.01，表1)。與空白對照組相比，加入濃度梯度的Ⅰ號化合物后，OD值顯著減小并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.05)，加入Ⅱ號化合物的實驗組與空白組之間OD值無明顯變化(圖1)。

2.2 Ⅰ號Ⅱ號化合物的抗腫瘤活性

陽性對照組Cisplatin(IC50)為9.318 μg/ml；Fluorouracil (IC50) 為13.125 μg/ml；與對照組相比加入Ⅰ號化合物后細胞無凋亡現(xiàn)象,OD值無明顯差異，IC50值>80 μg/ml；與對照組相比Ⅱ號化合物的IC50值12.174 μg/ml，細胞出現(xiàn)顯著凋亡(P<0.05，圖2)。

GroupDPPHABTSTrolox(IC50)ND4.8±0.557BHA(IC50)6.83±0.408NDⅠ(IC50)1.99±0.222**##1.49±0.168**##Ⅱ(IC50)NANA

BHA： Butyl hydroxyanisd； Trolox： 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid； Trolox and BHA as positive control groups； NA: No inhibitory activity at >40 μg/ml; ND: Not determined; IC50: A half of maximal inhibitoryconcentration

**P<0.01vstrolox group；##P<0.01vsBHA group

Fig. 1 Relationship of dose reaction bettween efficiency of radical-scavenging and phenol consentrations A: Capacity that Trolox and compound Ⅰ clear away ABTS free radical; B: Capacity that BHA and compound Ⅰ clear away DPPH free radical; ABTS: 2,2-Gzinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)

Fig. 2 Cisplatin and fluorouracil as positive control groups*P<0.05vscisplatin group;#P<0.05vsfluorouracil group

2.3 Ⅱ號化合物對K562細胞NF-κB P65 mRNA表達的影響

通過實時定量PCR測出的各組的Ct值通過Ct值采用2-ΔΔCt法算出mRNA的相對含量。空白對照組mRNA的表達量設(shè)定為1，三個藥物濃度組mRNA的表達量為空白組的倍數(shù)。與對照組相比加入Ⅱ號化合物的三個藥物濃度組mRNA的表達量隨著加入藥物濃度的增加而而呈現(xiàn)梯度增加(P<0.05，P<0.01，圖3)。

2.4 Ⅱ號化合物對四種蛋白表達的影響

NF-κB P65和FAS受體蛋白的表達量隨著藥物濃度的升高逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。β連環(huán)蛋白(β-catenin)和E-粘連蛋白(E -cadherin)二者共同參與細胞間的粘附；通過實驗結(jié)果可知二者表達量隨藥物濃度的增加呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢(P<0.05，P<0.01，圖4)。

Fig. 3 Expression of NF-κB P65 mRNA in K562 cell*P<0.05，**P<0.01vsblank group

Fig. 4 Expression levels of protein P65, Fas, E-cadherin and β-catenin in the K562 cells A: P65; B: Fas; C: E-cadherin and β-catenin*P<0.05，**P<0.01vsblank group

3 討論

現(xiàn)代研究表明：自由基是引起多種疾病和老化的主要原因；自由基能引起機體的許多連鎖反應(yīng)而后又經(jīng)過體內(nèi)代謝引起脂質(zhì)、DNA、細胞膜等體內(nèi)大分子損傷，這又是多種疾病，如癌癥、心血管疾病、炎癥等的誘因[5]，因此抗氧化劑的研究越來越受到重視。但由于市場上使用的多種抗氧化劑是化學(xué)合成的并且多具有不良反應(yīng)，所以篩選能有效防御自由基損害的天然來源的抗氧化劑是目前研究的熱點。

NF-κB P65作為核轉(zhuǎn)錄因子主要參與機體炎癥、免疫反應(yīng)、細胞增殖和凋亡過程的基因表達，在很多研究中都表明NF-κB P65與細胞增殖關(guān)系密切[6]。NF-κB通過上調(diào)抑制P53依賴的凋亡和上調(diào)Bcl-2家族抗凋亡成員和Caspase抑制劑如(XIAP和FILP)介導(dǎo)許多信號存活反應(yīng)[7]；相反，NF-κB也被DNA損傷中的凋亡刺激所激活介導(dǎo)促凋亡基因(如TRAIL R2/DR5 以及Fas和Fas配體)上調(diào)[8]；在K562細胞中，加入苯酚類Ⅱ號藥物后，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB P65的表達量明顯上調(diào)，NF-κB P65作為核轉(zhuǎn)錄因子，它的激活受上游Ikk激酶和AKT激酶的調(diào)控[7]，下游受控制因子包括參與炎癥、增殖、分化以及凋亡等相關(guān)因子，然而通過實時定量PCR以及Western blot實驗表明NF-κB P65的表達在加入藥物后明顯上調(diào)，并且隨著藥物濃度的升高呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。NF-κB不同的激活途徑可引起不同的促凋亡蛋白(如FAS、C-MYC和P53)或抗凋亡蛋白(如TRAF2、IAP蛋白和BCL-2蛋白)的產(chǎn)生[8]；通過Western blot實驗表明下游的Fas受體表達升高，可能是因為NF-κB P65參與了Fas的表達[9]，從而誘導(dǎo)了下游蛋白因子Caspase家族(半光天冬酶)的活化和激活，直接參與細胞凋亡。

黏附分子的表達或功能的改變被認為參與了癌癥的進展，大多數(shù)腫瘤源自于上皮組織并且 E-cadherin 對上皮組織的組織構(gòu)成至關(guān)重要。研究表明：在腫瘤進展過程中，發(fā)生了E-cadherin 介導(dǎo)的細胞與細胞黏附的缺失，這也是隨后的腫瘤擴散或轉(zhuǎn)移所需要的條件。由于癌癥患者主要的死亡原因是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移性的擴散，因此，許多研究集中在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移性過程中的細胞黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[10]。E-cadherin是一類粘蛋白家族，參與由鈣依賴的細胞與細胞之間的粘連，它保持細胞結(jié)合在一起以維護組織的完整性，這種跨膜連接絲蛋白含有胞外結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合另一個細胞的鈣粘蛋白，鈣粘蛋白也有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合連環(huán)蛋白(catenin)家族的連接絲蛋白[11]，連環(huán)蛋白家族蛋白能結(jié)合肌動蛋白的細胞骨架，作為細胞質(zhì)內(nèi)部的腳手架。因此當(dāng)兩個細胞經(jīng)鈣粘蛋白聯(lián)系在一起時，肌動蛋白細胞骨架也間接連接。然而，β-catenin存在于細胞的三個不同區(qū)域：細胞膜粘連連接處、游離細胞質(zhì)、細胞核中。β-catenin是粘連系統(tǒng)的主要組成成分，同時也是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵激活因子，能與E-cadherin形成復(fù)合物從而參與細胞與細胞之間的粘附[12]。通過Western blot實驗測得二者的表達量均上調(diào)，說明二者參與了細胞之間的粘附，說明苯酚類藥物使得兩種因子的表達上調(diào)促進了細胞之間的粘附，這對抑制腫瘤的遷移與擴散具有重要的意義。然而β-catenin是否參與了Wnt/β-catenin信號通路目前還不太清楚，但是也不能排除β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚，轉(zhuǎn)而入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合激活下游靶基因的表達[13]。本實驗的研究結(jié)果表明苯酚類Ⅱ號藥物誘導(dǎo)上游NF-κB P65、FAS、β-catenin和 E-cadherin的表達促進了腫瘤細胞的凋亡，增加了細胞間的粘附，對防止腫瘤細胞的擴散具有重大意義。

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A study involving antioxidizability and cytotoxicity of two kinds of phenol from Ajania Salicifolia and their mechanisms of apoptosis

ZHANG Wei1,2, WU Hong-ru4， LIANG Qiang-kun1, LI Yun-xia1, LU Yan-yu2, LONG Yao2, ZHU Ying4, LI Hong-fang1,2,3△

(1. Department of Physiology, College of Basic Medicine, 2. Key Laboratory of Preclinical Study for New Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, 3. Functional Laboratory of Medicine, 4. State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective: To extract two kinds of phenols 4- hydroxy-3,5-dimethoxy-4-(2-oxopropyl)cyclohexa-2,5-dien-1-one and 6-methoxy-5,7-dihydroxy coumarin (named as Ⅰ and Ⅱ compounds respectively) from Ajania salicifolia and to investigate their antioxidation and cytotoxicity to tumors and explore their pro-apoptosis mechanism. Methods: The antioxidant activities of two compounds were assessed by ABTS and DPPH radical-scavenging assays. Two compounds were evaluated for their cytotoxicity against human chronic myelogenous leukemia (K562) cells using the MTT assay. The expression of NF-κB P65 mRNA in K562 apoptotic cells was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time quantitative PCR. In addition, protein expression levels of the NF-κB P65, p-Akt, Fas, β-catenina and E-cadherin were also measured by Western blot. Results: ① We found that compound Ⅰ displayed significant inoxidizability, while compound Ⅱ had no obvious antioxidizability. ② In cytotoxicity experiments, compound Ⅰ didn’t display cytotoxicity while compound Ⅱ displayed obvious cytotoxicity. ③ Compared with the blank group, the expression of NF-κB P65 mRNA in K562 cell after treatment with compound Ⅱ was obviously up-regulated. ④ Compared with the blank group, the expression levels of NF-κB P65, Fas, β-catenina and E-cadherin were significantly increased in compound Ⅱ treated groups and it appeared obvious dose-effect relationship between the expression of protein and drug concentration. Conclusion: Two phenols have obvious antioxidizability and cytotoxicity respectively. On the one hand, the tumor-suppressing mechanism of compound Ⅱmaybe act by up-regulation the expression of NF-κB P65 and Fas protein; thereby, affecting the classical Fas apoptosis signaling pathways.On the other hand,it can also up-regulate the expression of protein β-catenin and E-cadherin, which participate in the adhesion between cells, and accordingly, playing an important role in preventing the proliferation and metastasis of cancer cells.【KEY WORDS】 phenolcompounds； inoxidizability； cytotoxicity； NF-κB P65； Fas； β-catenin； E-cadherin

國家自然科學(xué)基金資助項目(21272103)

2014-12-29 【修回日期】2014-12-25

R730.53

A

1000-6834(2015)05-422-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.011

△【通訊作者】Tel： 0931-8289019； E-mail： Lihf@lzu.edu.cn