咪達唑侖對hERG鉀通道的作用*

韓圣娜， 王 沛， 張 衛(wèi)， 張莉蓉△

(1. 鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室， 2. 鄭州大學藥學院， 河南 鄭州 450001； 3. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院麻醉科， 河南 鄭州 450052)

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咪達唑侖對hERG鉀通道的作用*

韓圣娜1， 王 沛2， 張 衛(wèi)3， 張莉蓉1△

(1. 鄭州大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室， 2. 鄭州大學藥學院， 河南 鄭州 450001； 3. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院麻醉科， 河南 鄭州 450052)

目的：觀察咪達唑侖對人胚腎上皮細胞(HEK-293)中異源表達的人類相關基因(hERG)鉀電流作用及其機制。方法：利用全細胞膜片鉗技術，觀察咪達唑侖對hERG鉀通道的抑制作用，分析其對通道激活、失活動力學過程的影響以及咪達唑侖對Y652A和F656C突變型hERG鉀通道的作用。結(jié)果：咪達唑侖濃度依賴性地抑制hERG鉀電流，其IC50值為(1.31±0.32)μmol/L。1.0 μmol/L的咪達唑侖加藥前后半數(shù)激活電壓V1/2由(2.32±0.38)mV變?yōu)?-1.96±0.83)mV；加藥前后半數(shù)失活電壓V1/2由(-49.25±0.69)mV變?yōu)?-57.53±0.53)mV(P<0.05)，失活曲線左移；與野生型(WT)比較，Y652A和F656C突變型可顯著減弱咪達唑侖對hERG通道的阻斷作用。結(jié)論：咪達唑侖能阻斷hERG鉀通道，失活速度加快，Y652和F656可能是咪達唑侖與hERG鉀通道結(jié)合的關鍵位點。

咪達唑侖； hERG鉀通道；全細胞膜片鉗；HEK-293細胞

心律失常是圍手術期常見的一種心血管并發(fā)癥，是導致患者死亡的重要因素之一。其中圍手術期出現(xiàn)QT間期延長，誘發(fā)藥源性長QT綜合征(long QT syndrome，LQTS)，尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsade de pointes，TdP)，甚至猝死等，均增加麻醉和手術的風險，引起臨床麻醉醫(yī)生的高度重視[1,2]。臨床上多種藥物通過抑制由人類相關基因(human ether-a-go-go,hERG)編碼的快速激活延遲整流鉀通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，引起心肌動作電位復極3期K+外流減少，造成QT間期延長[3-5]。

咪達唑侖是一種快速和相對短效的苯二氮卓類藥物，具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠、順行性遺忘、抗焦慮、抗驚厥的作用，常作為全麻術前和誘導用藥。在臨床工作中發(fā)現(xiàn)少數(shù)病例使用咪達唑侖后出現(xiàn)心率輕度增快，血壓輕度下降，說明其對心血管系統(tǒng)有輕微抑制作用[6,7]。

本課題采用全細胞膜片鉗技術觀察咪達唑侖對人胚腎上皮細胞(human embryonic kidney cells，HEK-293)上異源表達的hERG鉀電流的影響及其機制，初步探討咪達唑侖的心血管不良反應，從而為圍術期合理用藥提供理論依據(jù)，減少圍術期心臟不良反應的發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

編碼IKr的hERG基因的真核細胞表達載體pcgi-EGFP-hERG由張朝教授饋贈(南京師范大學生命科學院)。pcgi-Y652A-hERG(酪氨酸突變?yōu)楸彼?和pcgi-F656C-hERG突變體(苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?由本實驗室經(jīng)PCR定點突變技術而得并保存。

1.2 藥品和試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibico公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogene公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。咪達唑侖購自北京匯智泰康生物技術有限公司(純度99.8%)，溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，實驗時用正常臺式液稀釋，配成所需終濃度(DMSO在體系中的最大濃度<0.1%，不影響hERG電流的記錄)[8]。

1.3 HEK-293細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

HEK-293細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染的方法將hERG基因表達在HEK-293細胞，轉(zhuǎn)染36～48 h后取出細胞準備做全細胞膜片鉗記錄[9,10]。

1.4 hERG鉀電流的記錄

將表達有綠色熒光蛋白(EGFP)的HEK-293細胞的35 mm培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡的操作臺上，更換為細胞外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 10，用1.0 mol/L的NaOH滴定pH至7.4。使用的微電極尖端約0.5～1 μm，充以電極內(nèi)液(mmol/L)：KCl 140，MgCl21，EGTA 5，Na2ATP 5，HEPES 10，1 mol/L KOH滴定pH值至7.2，阻抗為2～5 MΩ。高阻封接形成后行串連電阻和電容電流補償，形成全細胞記錄模型。實驗過程由計算機軟件pulse 8.67(HEKA Elektronik，Germany)完成刺激信號的產(chǎn)生、反饋信號的采集以及數(shù)據(jù)分析。用電壓鉗模式進行刺激和記錄hERG鉀電流。采用累積加藥的方法記錄不同濃度的咪達唑侖作用5 min后對hERG鉀電流的作用[9,10]。

在形成全細胞模式后，采用維持電位-80 mV，以10 mV為階躍，施以-40 mV至+70 mV持續(xù)3 s的一系列去極化刺激，最后復極電位至-40 mV，持續(xù)2 s，采樣頻率0.25 kHz，刺激間隔15 s，記錄hERG鉀電流。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 咪達唑侖對WT-hERG鉀通道的濃度依賴性抑制作用

在大部分指令電壓下咪達唑侖均可抑制hERG時間依賴性電流和尾電流(圖1A)。以電壓為橫坐標，相應的電流值為縱坐標，得出1 μmol/L的咪達唑侖灌流前后電壓-電流曲線(I-V)的變化(圖1B、圖1C)。

以咪達唑侖的濃度(0.001，0.01，0.1，1.0，10，30和100 μmo/L)對數(shù)為橫坐標，給藥前后的電流比值為縱坐標，得量-效關系曲線(圖1D)。結(jié)果顯示，咪達唑侖抑制WT-hERG鉀通道電流的半數(shù)最大抑制濃度(half-maximum block concentrations，IC50)值為(1.31±0.32) μmol/L，Hill系數(shù)為0.24±0.02。

Fig. 1 Effects of midazolam on human ether-a-go-go-related gene (hERG) currents elicited by depolarizing voltage pulses A: Superimposed current traces elicited by 3 s depolarizing voltage pulses in 10 mV increments (upper panel) from a holding potential of -80 mV in the absence of midazolam (control, left panel) and in the presence of 1 μmol/L midazolam (right panel)；B and C: I-V relationships for (B) current measured at the end of depolarizing steps and (C) tail currents in control cells and in cells exposed to 1 μmol/L midazolam； D: Concentration-effect relationship for current inhibition by midazolam

2.2 咪達唑侖對WT-hERG鉀通道激活曲線和失活曲線的影響

標準化hERG尾電流后，數(shù)據(jù)經(jīng)Boltzmann sigmnidal方程擬合，可得WT-hERG的穩(wěn)態(tài)激活曲線(圖2A)。1 μmol/L的咪達唑侖加藥前后半數(shù)激活電壓V1/2由(2.32±0.38) mV變?yōu)?-1.96±0.83) mV，激活斜率k由(11.87±0.33) mV變?yōu)?14.68±0.76) mV，統(tǒng)計學處理無顯著性差異。

穩(wěn)態(tài)失活曲線的引出采用三脈沖程序的方法[10]，首先從維持電位-80 mV去極化至+20 mV，持續(xù)時間4 s，其次復極化至不同測試電壓(-130～+20)mV，持續(xù)時間 20 ms，最后再去極化至+20 mV，即可引出在各個測試電壓下從前一失活中恢復的通道產(chǎn)生的電流。

以測試電壓為橫坐標，相應電壓下hERG鉀電流與最大電流的比值為縱坐標，經(jīng)Boltzmann方程擬合得穩(wěn)態(tài)失活曲線(圖2B)。結(jié)果顯示1.0 μmol/L的咪達唑侖加藥前后半數(shù)失活電壓V1/2由(-49.25±0.69)mV變?yōu)?-57.53±0.53)mV，失活斜率k由(19.66±0.61)mV變?yōu)?21.45±0.46)mV(P<0.05)。

2.3 咪達唑侖對Y652A-hERG和F656C-hERG鉀電流的作用

hERG鉀通道在S6羧基端652、656位置上分別是芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸，Y652和F656是許多藥物與hERG鉀通道相互作用的重要結(jié)合位點，為了判定咪達唑侖與這兩個位點是否也有親和力，該課題組探討了咪達唑侖對Y652A和F656C突變體的阻滯作用。選用的咪達唑侖的濃度為10、30、100 μmol/L(超過咪達唑侖抑制WT-hERG鉀通道的IC50值的7～70倍)。

圖3A比較了10 μmol/L的咪達唑侖用于WT-hERG和Y652A-hERG鉀電流的變化。圖3B具體比較了三個不同濃度下咪達唑侖對WT-hERG和Y652A-hERG鉀通道電流的變化。當咪達唑侖濃度分別為10、30和100 μmol/L時，其對WT-hERG鉀通道分別抑制了(60.3±6.4)%、(64.0±1.3)%和(77.6±2.1)%；對Y652A-hERG鉀電流分別抑制了(27.2±3.8)%、(61.9±3.3)%和(82.1±1.5)%。

由于F656C-hERG鉀通道具有低細胞膜表達的特點，在正常細胞外液時不易引出外向尾電流，故實驗中采用含高鉀的細胞外液(95 mmol/L K+)。先給與細胞一個+20 mV的去極化脈沖，隨后將細胞復極至-120 mV，引出其內(nèi)向尾電流(圖4A)。當咪達唑侖的濃度分別為10、30和100 μmol/L時，其對WT-hERG鉀通道分別抑制了(67.1±6.9)%、(75.6±3.6)%和(81.2±4.1)%；對F656C-hERG鉀通道分別抑制了(22.5±7.4)%、(31.2±5.8%)和(56.5±8.5%，圖4B)。

3 討論

各種麻醉藥引起心電圖QT間期異常，導致發(fā)作性暈厥、心臟猝死的心律失常時有發(fā)生。由于臨床上麻醉藥物多和其它藥物同時使用，很難判定是麻醉藥物對QT間期的單一作用[11,12]。關于咪達唑侖對QT間期影響的臨床報道不多，有資料顯示其對QT間期無明顯影響或略有延長[13]。此外，鑒于麻醉藥物對離子通道影響的復雜性，增加了在體動物研究的難度，動物實驗又有其局限性，因此本實驗為了解咪達唑侖對QT間期的影響及其機制，應用異源表達系統(tǒng)HEK-293細胞，觀察其對QT間期影響的分子機制。

研究發(fā)現(xiàn)[14]，咪達唑侖的臨床效應與血藥濃度相關，40 ng/ml(約0.12 μmol/L)時開始出現(xiàn)效應，80 ng/ml(約0.24 μmol/L)時出現(xiàn)催眠作用，而該實驗結(jié)果顯示咪達唑侖濃度依賴性地抑制hERG鉀通道，其IC50值為(1.31±0.32)μmol/L。這說明咪達唑侖在正常劑量適用范圍內(nèi)通常是安全的，但若超過血藥濃度的5～10倍時有發(fā)生QT間期延長的潛在危險。

咪達唑侖不影響hERG鉀通道激活動力學，但使穩(wěn)態(tài)失活動力學曲線左移，加快了失活速度，這說明咪達唑侖可使動作電位時程的復極時間延長，可能會引起QT間期延長，是其致心律失常的主要原因。hERG鉀通道在其跨膜片段S6的羧基端656、652位置上對應的是苯丙氨酸和酪氨酸，而這兩個芳香族氨基酸殘基(F656和Y652)已被證實與許多藥物有高度的親和力，是藥物與hERG鉀通道相互作用的重要結(jié)合位點[15]。如果這些位點發(fā)生突變，將會削弱藥物抑制hERG鉀通道的作用能力。本課題研究發(fā)現(xiàn)Y652和F656位點的突變削弱了咪達唑侖對hERG鉀通道的阻斷能力，說明Y652和F656可能是咪達唑侖阻斷hERG通道的重要結(jié)合位點。

咪達唑侖是圍手術期常用的較安全藥物，但是根據(jù)本實驗結(jié)果其仍有致QT間期延長的潛在危險，尤其是當患者圍術期存在電解質(zhì)紊亂(如低鎂血癥、低鉀血癥等)，心臟疾病(如心肌梗塞、嚴重的心力衰竭、肥厚型心肌病、嚴重的心動過緩、心臟瓣膜異常等)，同時使用其它易引起QT間期延長的藥物，這些因素會增加咪達唑侖對hERG鉀通道作用易感性。因此患者圍術期出現(xiàn)QT間期延長，往往是多種因素相互作用的結(jié)果，作為麻醉醫(yī)生我們應高度警惕引起QT間期延長的潛在因素，做全面的圍術期風險評估，針對不同的患者的選擇合適的藥物，盡量避免心臟不良反應的發(fā)生。

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Effects of midazolam on hERG K+channel

HAN Sheng-na1, WANG Pei2, ZHANG Wei3, ZHANG Li-rong1△

(1. Department of Pharmacology, School of Medicine, 2. Department of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000;3. The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

Objective: To investigate the effect of midazolam on human ether-a-go-go (hERG) K+channels exogenously expressed in human embryonic kidney cells (HEK-293) and the underlying molecular mechanisms. Methods: Whole-cell patch clamp technique was used to record WT, Y652A and F656C hERG K+current expressed in HEK-293 cells. Results: Midazolam inhibited hERG K+current in a concentration-dependent manner, the half-maximum block concentrations(IC50)values were (1.31±0.32) μmol/L. The half-activation voltage (V1/2) were (2.32±0.38) mV for the control and (-1.96±0.83) mV for 1.0 μmol/L midazolam. The half-inactivation voltage (V1/2) was slightly shifted towards negative voltages from (-49.25±0.69) mV in control to (-57.53±0.53) mV after 1.0 μmol/L midazolam (P<0.05). Mutations in drug-binding sites (Y652A or F656C) of the hERG channel significantly attenuated the hERG current blockade by midazolam. Conclusion: Midazolam can block hERG K+channel and cause the speed of inactivation faster. Mutations in the drug-binding sites (Y652 or F656) of the hERG channel were found to attenuate hERG current blockage by midazolam.

midazolam; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cells

國家自然科學基金青年基金(81200138)

2014-09-23 【修回日期】2014-10-30△

Tel: 0371-67781855; E-mail: zhanglirongzzu@126.com

R978.1

A

1000-6834(2015)02-143-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.013