補(bǔ)鐵對(duì)低氧訓(xùn)練大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響*

李 潔, 陳 飛

(西北師范大學(xué)體育學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

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補(bǔ)鐵對(duì)低氧訓(xùn)練大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響*

李 潔△, 陳 飛

(西北師范大學(xué)體育學(xué)院， 甘肅 蘭州 730070)

目的：探討補(bǔ)鐵對(duì)低氧訓(xùn)練大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為低氧對(duì)照組(HC)，低氧訓(xùn)練組(HT)，小劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(SHT)，中劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(MHT)，大劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(LHT)，比較各組大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ(CⅠ～Ⅳ)的活性。結(jié)果：①與HC組相比： HT組CⅠ、CⅡ活性均顯著提高(P<0.01)，CⅢ、CⅣ活性均有顯著下降(P<0.05 ，P<0.01)；SHT組CⅠ～Ⅳ活性均顯著提高(P<0.05 ，P<0.01)，MHT組CⅠ、CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.05 ，P<0.01)； LHT組CⅠ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)，CⅢ活性顯著下降(P<0.01)。②與HT組相比： SHT組CⅠ活性顯著性下降(P<0.05)，CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)； MHT組CⅠ和CⅡ活性均顯著降低(P<0.01)，CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)；LHT組CⅡ活性顯著降低(P<0.01)，CⅣ活性顯著提高(P<0.01)。結(jié)論：低氧訓(xùn)練及復(fù)合補(bǔ)鐵，對(duì)肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響較為復(fù)雜，在提高呼吸鏈起始酶活性方面單獨(dú)的低氧訓(xùn)練效果最佳，在提高呼吸鏈關(guān)鍵酶活性方面，小劑量和中劑量補(bǔ)鐵的效應(yīng)要好于大劑量補(bǔ)鐵，大劑量補(bǔ)鐵要好于單獨(dú)的低氧訓(xùn)練。合理的低氧訓(xùn)練及補(bǔ)鐵有可能改善線(xiàn)粒體呼吸鏈功能，但低氧訓(xùn)練期間補(bǔ)鐵應(yīng)慎重。

補(bǔ)鐵；低氧訓(xùn)練；肝臟；線(xiàn)粒體；呼吸鏈；大鼠

iron supplement; hypoxia train; liver; mitochondria; respiratory chain; rat

低氧訓(xùn)練作為一種特殊的訓(xùn)練手段在國(guó)內(nèi)外正逐漸流行,目前有關(guān)低氧訓(xùn)練與鐵代謝關(guān)系的研究還比較少且主要集中在血液指標(biāo)方面[1]。由于鐵還是線(xiàn)粒體呼吸鏈重要的電子傳遞體，所以一旦鐵缺乏將會(huì)影響線(xiàn)粒體呼吸鏈功能，進(jìn)而影響機(jī)體的能量供應(yīng)及運(yùn)動(dòng)能力。肝臟是鐵代謝及其調(diào)節(jié)的中心器官，且對(duì)維持血糖穩(wěn)定有重要作用，因此肝臟的物質(zhì)代謝和能量代謝對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的提高有積極的作用。為了進(jìn)一步探討鐵元素對(duì)低氧訓(xùn)練效果的影響，本研究以大鼠為研究對(duì)象，利用人工低氧環(huán)境進(jìn)行低氧訓(xùn)練并復(fù)合補(bǔ)充不同劑量的硫酸亞鐵，通過(guò)測(cè)定大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的活性，探討補(bǔ)鐵對(duì)低氧訓(xùn)練大鼠肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性健康2月齡Wistar大鼠55只(SPF級(jí))，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：〔SCXK(甘)2005--007〕]，體重150 g 左右。動(dòng)物適應(yīng)性訓(xùn)練、篩選及常規(guī)管理參見(jiàn)文獻(xiàn)[2]。將篩選出的40只大鼠隨機(jī)分為5組(n=8)：低氧對(duì)照組(HC)，低氧訓(xùn)練組(HT)，小劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(SHT)，中劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(MHT)，大劑量補(bǔ)鐵+低氧訓(xùn)練組(LHT)。

1.2 補(bǔ)鐵方法及劑量

補(bǔ)鐵組大鼠灌胃補(bǔ)充硫酸亞鐵溶液，小劑量為28.85 mg/(kg·d)，中劑量為57.7 mg/(kg·d)，大劑量為115.4 mg/(kg·d)[3]。低氧對(duì)照組和低氧訓(xùn)練組補(bǔ)充中劑量的蒸餾水。所有大鼠每周周一稱(chēng)體重1次。

1.3 訓(xùn)練方案

用自制低壓氧艙模擬海拔3 500 m(氧濃度為13.6%)的環(huán)境，訓(xùn)練大鼠在低氧環(huán)境進(jìn)行每周6 d共5周的水平跑臺(tái)(DSPT-202型動(dòng)物跑臺(tái)，中國(guó)杭州段氏制作)遞增負(fù)荷訓(xùn)練[4-5]。第1周跑臺(tái)速度為20 m/min ，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30 min ；第2周跑臺(tái)速度為25 m/min ，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為40 min；第3周跑臺(tái)速度為25 m/min ，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為50 min ；第4周跑臺(tái)速度為30 m/min ，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min；第5周跑臺(tái)速度為35 m/min ，運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60 min。低氧對(duì)照組在低氧環(huán)境中生活，不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.4 取材及線(xiàn)粒體制備

第5周訓(xùn)練結(jié)束后在常氧環(huán)境中休息1天，第6周周一所有大鼠進(jìn)行速度為35 m/min水平跑臺(tái)力竭運(yùn)動(dòng)。所有大鼠力竭后即刻腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，取樣及線(xiàn)粒體制備過(guò)程參見(jiàn)文獻(xiàn)[6]。離心機(jī)為UNIVERSAL 32R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó))。

1.5 測(cè)試指標(biāo)及方法

線(xiàn)粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ (CⅠ～Ⅳ)活性參照Vyatlina等[7]的方法進(jìn)行測(cè)定，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。分光光度計(jì)為UVmini-1240島津紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(日本島津精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.6 試劑與藥品

NADH(nicotinamide adenine dinuclectide-reduced)、 魚(yú)藤酮(rotenone)、2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzoquinone (DB，CoQ0)、細(xì)胞色素c(Cyt c)、抗霉素(antimycin)、β-裂解劑(Dodecyl-β-D-maltoside)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、考馬斯亮藍(lán)G250為sigma公司產(chǎn)品，2,6-dichlorophenolindophenol sodium salt hydrate (DCPIP)為 Fluka 公司產(chǎn)品，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

與HC組相比(表1)： HT組CⅠ、CⅡ活性均顯著提高(P<0.01)，分別提高81.5%、130.4%； CⅢ、CⅣ活性均顯著下降，分別下降22%(P<0.05)、20.2%(P<0.01)。SHT組CⅠ～Ⅳ活性均顯著提高，分別提高15.3%(P<0.05)、134.8%(P<0.01)、57.8%(P<0.01)和26.6%(P<0.01)。MHT組CⅠ、CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01),分別提高18.8%、82.6%和26.8%； CⅡ活性下降14.5%，但無(wú)顯著變化。LHT組CⅠ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)，分別提高67.7%和18.4%； CⅡ活性增長(zhǎng)4.3%，但無(wú)顯著變化； CⅢ活性顯著下降36.9%(P<0.01)。

與HT組相比(表1)： SHT組CⅠ活性顯著性下降36.4%(P<0.05)，CⅡ活性增長(zhǎng)1.9%，無(wú)顯著變化，CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)， 分別提高102.3%和58.7%； MHT組CⅠ和CⅡ活性均顯著降低(P<0.01)，分別降低34.5%和62.9%，CⅢ和CⅣ活性均顯著提高(P<0.01)，分別提高134%和58.9%。LHT組CⅠ和CⅢ活性分別降低7.6%和19.1%，但無(wú)顯著性變化，CⅡ活性顯著降低54.7%(P<0.01)，CⅣ活性顯著提高48.5%(P<0.01)。

Tab. 1 Compare of activities of respiratory chain CⅠ～Ⅳ in rat liver mitochondria among groups(μmol/(mg pro·min)， ±s, n=8)

HC: Hypoxic control; HT: Hypoxic training; SHT: Small dose iron; MHT: Middle dose iron; LHT: Large dose iron; CⅠ： Respiratory chain complexes Ⅰ； CⅡ： Respiratory chain complexes Ⅱ； CⅢ： Respiratory chain complexesⅢ； CⅣ： Respiratory chain complexes Ⅳ

*P<0.05，**P<0.01vsHC group；#P<0.05，##P<0.01vsHT group

3 討論

現(xiàn)已得知，線(xiàn)粒體氧化磷酸化是由線(xiàn)粒體內(nèi)膜呼吸鏈完成的，而鐵在線(xiàn)粒體氧化磷酸化過(guò)程中扮演著極為重要的角色，呼吸鏈組成的前3種復(fù)合物中都含有鐵硫蛋白(Fe-S)，其是一種重要的電子傳遞體和載氧體，影響著生物體的物質(zhì)代謝和能量代謝[8]。

本課題組前期研究表明，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練期間復(fù)合補(bǔ)鐵，可提高肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能及機(jī)體有氧工作能力。從運(yùn)動(dòng)能力考慮，中劑量補(bǔ)鐵效應(yīng)較好[6]。說(shuō)明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)鐵對(duì)呼吸鏈功能有影響。

低氧暴露是指有機(jī)體以任何方式暴露于高原自然低氧或人工低氧環(huán)境中。低氧訓(xùn)練是一種特殊的低氧暴露，特指在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練周期中持續(xù)或者間斷利用高原自然低氧或人工低氧環(huán)境，配合運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練來(lái)增加運(yùn)動(dòng)機(jī)體的缺氧程度，從而產(chǎn)生一系列有利于提高機(jī)體抗缺氧的生理反應(yīng)及適應(yīng)能力，調(diào)動(dòng)體內(nèi)的機(jī)能潛力，進(jìn)而達(dá)到提高運(yùn)動(dòng)能力的訓(xùn)練方法[9]。

低氧訓(xùn)練期間，運(yùn)動(dòng)員承受著低氧和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練雙重刺激，都可能導(dǎo)致機(jī)體鐵的缺乏，從而引起對(duì)機(jī)體的負(fù)面影響。大量研究結(jié)果都證實(shí)鐵的補(bǔ)充可以有效地改善機(jī)體鐵貯備下降的狀況，從而有利于運(yùn)動(dòng)能力的恢復(fù)[1]。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與低氧對(duì)照組相比，低氧訓(xùn)練組肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈酶CⅠ和CⅡ活性顯著提高，CⅢ和CⅣ活性顯著下降；小劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ～Ⅳ活性均顯著提高；中劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ、CⅢ和CⅣ活性顯著提高，CⅡ活性無(wú)顯著性變化；大劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ和CⅣ活性顯著提高，CⅡ活性無(wú)顯著變化， CⅢ活性顯著下降。說(shuō)明低氧訓(xùn)練及復(fù)合補(bǔ)鐵均對(duì)肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈酶活性有影響，其影響程度不盡相同，CⅠ活性HT>LHT>MHT>HTS，CⅡ活性SHT>HT>LHT>MHT，CⅢ活性MHT>SHT>HT>LHT，CⅣ活性MHT>SHT>LHT>HT。其中單獨(dú)低氧訓(xùn)練組CⅠ的活性最高，小劑量補(bǔ)鐵低氧訓(xùn)練組CⅡ的活性最高，中劑量補(bǔ)鐵低氧訓(xùn)練組CⅢ和CⅣ的活性均最高。另外，單獨(dú)低氧訓(xùn)練使CⅢ和CⅣ活性顯著下降，低氧訓(xùn)練復(fù)合大劑量補(bǔ)鐵使CⅢ活性顯著下降，低氧訓(xùn)練復(fù)合小劑量和中劑量補(bǔ)鐵使CⅢ活性顯著提高，低氧訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)鐵均可提高CⅣ的活性。與單獨(dú)的低氧訓(xùn)練組相比，小劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ活性顯著下降，CⅡ活性無(wú)顯著性變化，CⅢ和CⅣ活性顯著提高；中劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ和CⅡ活性顯著降低，CⅢ和CⅣ活性均顯著提高。大劑量補(bǔ)鐵訓(xùn)練組CⅠ和CⅢ活性無(wú)顯著性變化，CⅡ活性顯著降低，CⅣ活性顯著提高。說(shuō)明低氧訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)鐵不利于CⅠ、CⅡ活性的進(jìn)一步提高，而有利于CⅢ和CⅣ活性的改善。

已有研究認(rèn)為氧化呼吸鏈中的限速步驟是在細(xì)胞色素b-c1(CⅢ)[10]，CⅣ是呼吸鏈唯一的氧化酶，其作用是催化4個(gè)電子與氧結(jié)合，最后生成2分子H2O。由此可看出，就本實(shí)驗(yàn)的訓(xùn)練方案，低氧訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)鐵對(duì)肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響較為復(fù)雜，單純的低氧訓(xùn)練，可提高呼吸鏈起始酶——CⅠ和CⅡ的活性，但導(dǎo)致呼吸鏈關(guān)鍵酶——CⅢ和CⅣ活性顯著下降，復(fù)合補(bǔ)鐵后導(dǎo)致呼吸鏈起始酶——CⅠ和CⅡ的活性下降，呼吸鏈關(guān)鍵酶——CⅢ和CⅣ活性得到改善。在提高呼吸鏈起始酶活性方面單獨(dú)的低氧訓(xùn)練效果最佳，在提高呼吸鏈關(guān)鍵酶活性方面，小劑量和中劑量補(bǔ)鐵的效應(yīng)要好于大劑量補(bǔ)鐵，大劑量補(bǔ)鐵要好于單獨(dú)的低氧訓(xùn)練。其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。單獨(dú)低氧訓(xùn)練以及復(fù)合補(bǔ)鐵都不能提高線(xiàn)粒體呼吸鏈的整體功能，這可能還與開(kāi)始補(bǔ)充鐵的時(shí)間段、補(bǔ)鐵劑量和頻率及低氧訓(xùn)練方案等有關(guān)。提示合理的低氧訓(xùn)練復(fù)合補(bǔ)鐵有可能能改善線(xiàn)粒體呼吸鏈功能，但低氧訓(xùn)練期間補(bǔ)鐵應(yīng)慎重。

綜述可見(jiàn)，低氧訓(xùn)練及復(fù)合補(bǔ)鐵，對(duì)肝臟線(xiàn)粒體呼吸鏈功能的影響較為復(fù)雜，在提高呼吸鏈起始酶活性方面單獨(dú)的低氧訓(xùn)練效果最佳，在提高呼吸鏈關(guān)鍵酶活性方面，小劑量和中劑量補(bǔ)鐵的效應(yīng)要好于大劑量補(bǔ)鐵，大劑量補(bǔ)鐵要好于單獨(dú)的低氧訓(xùn)練。合理的低氧訓(xùn)練及補(bǔ)鐵有可能改善線(xiàn)粒體呼吸鏈功能，但低氧訓(xùn)練期間補(bǔ)鐵應(yīng)慎重。

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國(guó)家自然科學(xué)基金(31060145)；甘肅省自然科學(xué)基金(1107RJZA087)

2014-11-03

2015-02-26

G804.7

A

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10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.018

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