血液透析治療中透析器和透析液對(duì)急性期蛋白及細(xì)胞因子的影響

鐘 波 那 宇 周 磊 韋加美

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血液透析治療中透析器和透析液對(duì)急性期蛋白及細(xì)胞因子的影響

鐘 波 那 宇 周 磊 韋加美

目的：評(píng)估血液透析(HD)過(guò)程細(xì)胞因子白細(xì)胞介素6(IL-6)和一些急性期蛋白[C反應(yīng)蛋白(CRP)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)]的水平，分析HD誘導(dǎo)的急性期反應(yīng)與透析膜類(lèi)型或透析液的關(guān)系。 方法：10例患者行標(biāo)準(zhǔn)HD治療，在透析開(kāi)始、透析結(jié)束及透析后24h留取血液樣本，分別檢測(cè)IL-6,CRP 和 sPLA2水平，所有患者分別使用改良型纖維素膜透析器(FB)和聚砜膜透析器(PS)，另外5例患者為增強(qiáng)HD治療，即纖維素膜透析器加上一組透析液濾器(FBf)。 結(jié)果：FB組和FBf組在透析結(jié)束時(shí)IL-6水平顯著高于透析開(kāi)始時(shí)(P<0.05)，在透析后24h IL-6降至基礎(chǔ)水平，相反，PS組透析的患者IL-6水平無(wú)明顯波動(dòng)。在透析結(jié)束時(shí)FB組和FBf組IL-6水平顯著高于PS組患者(P<0.05)；FB和FBf組透析后24h時(shí)平均CRP水平顯著高于透析后水平(P<0.05)。兩組患者在透析后24h sPLA2水平較透析結(jié)束時(shí)顯著增高(P<0.05)。透析結(jié)束時(shí)IL-6水平與透析后24h CRP (r=0.67,P<0.01)水平和sPLA2(r=0.52,P<0.05)水平顯著正相關(guān)。但是使用PS膜透析患者，CRP以及sPLA2水平均無(wú)顯著性變化。 結(jié)論：與PS膜相比，F(xiàn)B 和 FBf膜透析治療結(jié)束時(shí)血清IL-6水平顯著升高，與開(kāi)始透析后24h后血清CRP 和 sPLA2水平的升高顯著正相關(guān)。因此，誘導(dǎo)HD急性期反應(yīng)的原因中，透析膜的生物學(xué)特性較透析液細(xì)菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(正常范圍內(nèi))意義更大。

血液透析 急性期反應(yīng) C反應(yīng)蛋白 白細(xì)胞介素6 分泌型磷脂酶A2

在血液透析(HD)過(guò)程中，患者血液和體外循環(huán)的各種人工材料(透析器、透析管路)之間相互接觸產(chǎn)生特異性反應(yīng)，臨床上稱(chēng)之為生物不相容性[1]，對(duì)機(jī)體而言透析材料是一種異物，長(zhǎng)期暴露在透析循環(huán)中，反復(fù)刺激引導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生急性期反應(yīng)。急性期反應(yīng)在HD相關(guān)并發(fā)癥有重要意義，包括感染風(fēng)險(xiǎn)增加、營(yíng)養(yǎng)不良和分解代謝增強(qiáng)、透析相關(guān)淀粉樣變，最終導(dǎo)致病死率增加。同時(shí)，這種生物不相容性對(duì)急性期反應(yīng)的類(lèi)型和程度也有重要影響。

急性期反應(yīng)是機(jī)體對(duì)炎癥和組織破壞后產(chǎn)生的一系列反應(yīng)狀態(tài)，它由機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的集成網(wǎng)絡(luò)介質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，包括前炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β (IL-1β),腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6 (IL-6)。IL-6主要來(lái)源于人體外周血單核細(xì)胞(PBMC)。細(xì)胞因子主要介導(dǎo)生成急性期反應(yīng)蛋白，包括C反應(yīng)蛋白 (CRP)和分泌型磷脂酶A2(sPLA2)。目前的臨床診療過(guò)程中， CRP廣泛應(yīng)用于監(jiān)測(cè)急性期反應(yīng)的過(guò)程和程度。通常在炎性刺激8～10h后，血清CRP水平開(kāi)始增加，最終能達(dá)到正常值的數(shù)百倍。

臨床常見(jiàn)的透析相關(guān)性急性期反應(yīng)綜合征包括發(fā)熱和低血壓反應(yīng)，主要原因?yàn)镻BMC激活，進(jìn)而前炎性細(xì)胞因子的大量釋放[1]。透析患者PBMC能被多種因素激活，包括補(bǔ)體活化、直接與透析膜接觸、醋酸鹽透析液、細(xì)菌污染所產(chǎn)生的內(nèi)毒素等。透析患者急性期反應(yīng)是否主要由細(xì)胞因子激活的物質(zhì)引導(dǎo)，臨床研究尚有很多疑問(wèn)[2-4]。

本實(shí)驗(yàn)旨在分析維持性HD患者急性期反應(yīng)的原因和程度。通過(guò)對(duì)比生物不相容性透析膜(FB)和相對(duì)生物相容性膜(PS)來(lái)觀察透析膜的生物學(xué)特征對(duì)急性期反應(yīng)的影響，同時(shí)通過(guò)對(duì)比碳酸氫鹽透析液和超純透析液來(lái)評(píng)估透析液污染對(duì)上述反應(yīng)的影響。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象 入選10例患者參與臨床實(shí)驗(yàn)，男性4例、女性6例，維持性HD時(shí)間至少18月(中位時(shí)間40月；范圍19～166月)。所有參試患者均簽署了知情同意書(shū)，中位年齡為62歲(范圍41～77歲)腎衰竭的基礎(chǔ)疾病包括：高血壓腎硬化6例、成人多發(fā)性腎囊性變2例、慢性腎盂腎炎1例、止痛藥腎病1例。除外標(biāo)準(zhǔn)包括：接觸透析膜后有過(guò)敏反應(yīng)的患者、惡性腫瘤、肝臟疾病、自身免疫性疾病、接觸過(guò)免疫抑制劑及近期有發(fā)熱和感染的患者。

研究方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為2部分，第一部分為隨機(jī)交叉對(duì)照研究，對(duì)補(bǔ)體激活程度較高的FB透析器和補(bǔ)體激活程度低的PS膜透析器進(jìn)行對(duì)比分析。為建立一個(gè)穩(wěn)定的血-膜接觸時(shí)間，參試患者分別使用兩種透析膜進(jìn)行透析治療，每組持續(xù)3周，每周3次，每次4h。在每周第三次透析時(shí)患者均留取血液標(biāo)本，在透析開(kāi)始、透析結(jié)束從透析管路的動(dòng)脈側(cè)留取，透析后24h通過(guò)正常靜脈穿刺留取。在透析開(kāi)始對(duì)透析液進(jìn)行無(wú)菌取樣，取三次結(jié)果均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)的第二部分，隨機(jī)選取5例患者進(jìn)行增強(qiáng)HD治療，使用超純透析液(費(fèi)森尤斯4008S提供制造超純透析液裝置)，同樣按照上述研究草案進(jìn)行實(shí)施。

透析操作步驟 所有參試患者均使用FB膜透析器 (FB150A,日本)和PS膜透析器(F7HPS,費(fèi)森尤斯,德國(guó))。FB150A膜材料為改良型醋酸纖維素膜，表面積為1.4 m2γ射線滅菌，超濾率為12.5 ml/(mmHg·h)，F(xiàn)7HPS膜材料為聚砜膜，表面積為1.3 m2高壓蒸汽滅菌，超濾率為14 ml/(mmHg·h)。HD治療前，透析器均使用含有5 000 IU 肝素的生理鹽水1 000 ml預(yù)沖。按照患者個(gè)體需要，血流量調(diào)整至200～300 ml/min。超濾(UF)率范圍(300～1 000 ml/h)。肝素抗凝，起始劑量范圍1 500～4 000 IU,維持劑量250～1 250 IU/h。透析液使用反滲水稀釋濃縮的碳酸氫鹽原液技術(shù)。費(fèi)森尤斯4008S使用內(nèi)毒素濾器以獲得超純透析液。

分析方法

IL-6 IL-6在EDTA血漿中檢測(cè)，使用酶免疫分析法(EIA)。樣本常規(guī)離心(10 min,1 500 r/min),-20℃保存。按照試劑盒制造商指導(dǎo)的方法檢測(cè)，測(cè)定低限為0.5 pg/ml。(人IL-6 ELISA 試劑盒48T 上海恒遠(yuǎn))。

CRP 常規(guī)比濁法測(cè)定血清CRP水平。測(cè)定低限為2 mg/L，在統(tǒng)計(jì)分析中，凡是結(jié)果低于測(cè)定低限的數(shù)據(jù)均指定為1 mg/L。檢測(cè)儀器：整合式生化分析儀西門(mén)子(Dimension RXL Max/Xpand Plus)。試劑盒：CRP測(cè)定試劑盒(免疫比濁法)(RCRP)

sPLA2sPLA2在EDTA血漿中檢測(cè)，使用酶免疫分析法，測(cè)定低限為0.1 ng/ml,健康對(duì)照組人群均低于5 ng/ml[5](人sPLA2 ELISA 試劑盒48T 上海凱博)。

內(nèi)毒素檢測(cè) 無(wú)菌采集透析液樣本，-20℃保存，內(nèi)毒素活性定量標(biāo)準(zhǔn)采用透析液樣本和鱟變形細(xì)胞溶解物/底物混合分析法(內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒 湛江博康)。

透析液細(xì)菌學(xué)評(píng)估 無(wú)菌采集透析液樣本，37℃孵育48h后，總平板細(xì)菌計(jì)數(shù)在葡萄糖酵母瓊脂平板完成，綿羊紅細(xì)胞技術(shù)在瓊脂平板完成。

統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，當(dāng)數(shù)據(jù)分布均衡時(shí)，用中位數(shù)和分布范圍表示。成對(duì)變量的變異分析使用成對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析使用Pearson’s相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

IL-6 三種透析模式(PS,FB和FBf)透析前IL-6平均水平無(wú)顯著性差異。使用PS膜透析的患者透析過(guò)程中IL-6水平無(wú)顯著波動(dòng)。反之，F(xiàn)B 和 FBf組患者透析后IL-6水平較透析前顯著性增高(FB組:從透析開(kāi)始時(shí)3.7±1.2 pg/ml到透析結(jié)束時(shí)9.4±2.9 pg/ml,t=-3.00,df=10,P<0.05； FBf組:從透析開(kāi)始時(shí)3.5±0.8 pg/ml到透析結(jié)束時(shí)7.9±4.1 pg/ml,t=-3.17,df=6,P<0.05)。在透析結(jié)束時(shí)，PS組患者IL-6水平和FB以及 FBf組患者有顯著性差異(P<0.05)。而FB和FBf組患者之無(wú)顯著性差異。透析24h后，F(xiàn)B組及FBf組患者，IL-6水平均降至正常水平(圖1)。

圖1 血液透析前后PS、FB及FBf組患者血清IL-6濃度IL-6：白細(xì)胞介素6；PS：聚砜膜；FB：醋酸纖維膜；FBf:醋酸纖維膜f濾器；*：與PS組比較，P<0.05

CRP和sPLA2三種透析模式(PS,FB和FBf)透析前CRP和sPLA2平均水平無(wú)顯著性差異。使用PS膜透析的患者透析過(guò)程中CRP和sPLA2平均水平均無(wú)顯著波動(dòng)。反之，使用FB膜透析，CRP(圖2)和sPLA2(圖3)平均水平在透析后24h較透析結(jié)束時(shí)均顯著增高(CRP:從透析結(jié)束5.6±1.1 mg/L到透析后24h 7.9±1.7 mg/L,t=-2.73,df=10,P<0.05； sPLA2:從t1807.1±1.2 ng/ml到透析后24h 12.2±2.7 ng/mlt=-3.16,df=10,P<0.05)。對(duì)于FBf組患者，CRP和sPLA2平均水平在透析后24h較透析結(jié)束時(shí)均明顯增高 (CRP:從透析結(jié)束5.9±1.9 mg/l到透析后24h 8.2±3.7 mg/L，P<0.05；sPLA2:從透析結(jié)束6.2±2.4 ng/ml到透析后24h 13.8±2.9 ng/ml，P<0.05)。FB和FBf組患者CRP平均水平在透析后24h較PS組患者增高，但只有FBf組患者的增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FB組:t=2.00,df=9,P=0.08； FBf組:t=4.32,df=6,P<0.01)。另外，F(xiàn)B和FBf組患者sPLA2平均水平在透析后24h較PS組患者均顯著性增高，(FB組:t=2.30,df=9,P<0.05；FBf組:t=2.50,df=6,P<0.05)，而FB和FBf組患者之間無(wú)顯著差異。

圖2 透析前后PS、FB及FBf組患者血清CRP濃度PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；CRP：C反應(yīng)蛋白

圖3 透析前后PS、FB及FBf組患者血清sPLA2濃度PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；sPLA2：分泌型磷脂酶A2

透析液內(nèi)毒素檢測(cè)指標(biāo) 使用內(nèi)毒素濾器獲得的超純透析液與標(biāo)準(zhǔn)透析液相比，內(nèi)毒素水平有顯著性差異(但均在正常允許范圍之內(nèi))，超純透析液：中位數(shù)0.06 (0.05～0.19) EU/ml；標(biāo)準(zhǔn)透析液：中位數(shù)0.18 (0.05～1.13) EU/ml(P<0.05)。

透析液細(xì)菌培養(yǎng) 所有超純透析液樣本只有一份檢測(cè)到細(xì)菌生長(zhǎng)，而超純透析液細(xì)菌含量較標(biāo)準(zhǔn)透析液有顯著性差異，超純透析液：中位數(shù)0 (0～10) cfu/ml；標(biāo)準(zhǔn)透析液：中位數(shù)45 (0～480) cfu/ml(P<0.05)。

IL-6、CRP與sPLA2之間相關(guān)性分析 三組患者(PS、FB 和 FBf)累計(jì)資料表明在透析結(jié)束時(shí)平均IL-6水平與透析后24h CRP水平(r=0.67,P<0.01；圖4A)及sPLA2水平(r=0.52,P<0.05；圖4B)顯著正相關(guān)。

內(nèi)毒素與IL-6、CRP、sPLA2之間相關(guān)性分析 檢測(cè)出內(nèi)毒素濃度無(wú)論是與透析結(jié)束時(shí)IL-6水平，還是與透析后24h急性期蛋白水平均無(wú)顯著相關(guān)性(IL-6:r=-0.32 NS；CRP:r=-0.27 NS； sPLA2:r=-0.25 NS)。

圖4 三組透析患者(PS,FB 和 FBf)累計(jì)資料表明透析結(jié)束時(shí)IL-6水平和透析后24hCRP水平呈顯著正相關(guān)(A)，同時(shí)與透析后24h sPLA2水平顯著正相關(guān)(B)PS：聚砜膜透析器；FB：改良型纖維素膜透析器；FBf：透析液濾器；IL-6：白細(xì)胞介素6；sPLA2：分泌型磷脂酶A2；CRP：C反應(yīng)蛋白

討 論

本實(shí)驗(yàn)旨在評(píng)估HD引起生物非相容性反應(yīng)的機(jī)制，主要通過(guò)測(cè)定急性期蛋白定量來(lái)評(píng)估， 觀察該反應(yīng)是否來(lái)源于透析膜的生物特性或透析液的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)比兩種類(lèi)型透析器：改良型醋酸纖維素膜(FB,纖維素材料，中通量，中補(bǔ)體激活性)和聚砜膜(PS,合成膜材料，中通量，低補(bǔ)體激活性)，同時(shí)，設(shè)定超純透析液透析模式，即FB透析膜+超純透析液(FBf)，所有透析液均為碳酸氫鹽緩沖液。

使用PS膜透析的患者，在所有觀察時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到的IL-6、CRP與sPLA2水平均無(wú)明顯變化，說(shuō)明PS膜有良好的生物相容性。對(duì)于FB和FBf組患者，透析結(jié)束時(shí)IL-6水平顯著增加，而透析后24h CRP與sPLA2水平顯著增加。FB和FBf組患者之間無(wú)顯著性差異，即使用標(biāo)準(zhǔn)透析液與超純透析液檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。另外，所有三組患者(PS、FB和FBf)累計(jì)資料表明透析液內(nèi)毒素含量(允許范圍內(nèi))與透析結(jié)束IL-6水平及透析后24h急性期蛋白水平無(wú)顯著相關(guān)性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明透析結(jié)束時(shí)血清IL-6平均水平與透析后24h CRP平均水平顯著正相關(guān)，透析治療過(guò)程中CRP水平基本無(wú)變化，在炎性刺激后8～10h CRP水平才逐漸增高[6]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

血清CRP水平升高是低蛋白血癥[5-6]、特異或非特異性炎癥、急性冠脈綜合征以及心血管事件的危險(xiǎn)因素。維持性HD患者CRP平均水平普遍升高，尤其是使用纖維素膜透析器的患者。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)評(píng)估不同膜材料透析器透析過(guò)程中IL-6的增高與透析后24h急性期蛋白升高之間的關(guān)聯(lián)，以及標(biāo)準(zhǔn)透析液和超純透析液對(duì)急性期蛋白的變化的影響。結(jié)果提示CRP與sPLA2的變化基本吻合，而臨床普遍認(rèn)為CRP與sPLA2聯(lián)合作用，促進(jìn)損傷細(xì)胞的吞噬作用，因而加重炎性反應(yīng)以及組織損害[7]，甚至可以認(rèn)為這種病理生理過(guò)程是維持性HD患者各種慢性并發(fā)癥的致病機(jī)制。

有資料表明，使用標(biāo)準(zhǔn)透析液與超純透析液相比[8]，細(xì)胞內(nèi)IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)含量顯著增加，從而誘導(dǎo)PBMC活性增加。但也有一項(xiàng)研究針對(duì)高通量血液透析[10]，分別使用標(biāo)準(zhǔn)碳酸氫鹽透析液和超純碳酸氫鹽透析液，對(duì)比細(xì)胞因子(IL-1β,IL-6,TNF-α)及細(xì)胞因子受體拮抗劑[IL-1Ra,可溶性 TNF 受體(sTNFR) p55和p75]均無(wú)顯著性差異。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不支持透析液的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)(透析液中內(nèi)毒素含量及透析液細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù))作為臨床碳酸氫鹽透析過(guò)程前炎性細(xì)胞因子及急性期蛋白生成的關(guān)鍵指標(biāo)。對(duì)于通量相對(duì)較高的PS透析膜，透析過(guò)程中無(wú)明顯細(xì)胞因子釋放，透析間期也沒(méi)有明顯急性期蛋白生成。對(duì)于中通量FB透析膜，透析過(guò)程中IL-6明顯增加，透析后24h也能檢測(cè)到顯著的急性期反應(yīng)，這種情況與透析液的細(xì)菌學(xué)指標(biāo)(正常范圍內(nèi))無(wú)關(guān)。另外，其他多種因素，如補(bǔ)體激活、直接接觸透析膜產(chǎn)生的膜衍生介質(zhì)均可能在FB透析膜介導(dǎo)的急性期反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用[9-10]。

綜上所述，使用FB透析器會(huì)誘導(dǎo)在透析結(jié)束時(shí)IL-6水平顯著提升，這與在透析后24h CRP和sPLA2的增高存在顯著相關(guān)性，而與透析液的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量無(wú)關(guān)(內(nèi)毒素含量及透析液細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù))，而使用PS透析器則未發(fā)現(xiàn)上述變化。因此，在HD相關(guān)的機(jī)體急性期反應(yīng)過(guò)程中，透析膜的特性比透析液的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量發(fā)揮更重要的作用。

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(本文編輯 紀(jì) 文)

Effects of dialyser and dialysate on the acute phase proteins and cytokines in patients with hemodialysis

ZHONGBo,NAYu，ZHOULei，WEIJiamei

DepartmentofNephrology,306HospitalofPLA,Beijing100101,China

WEIJiamei(E-mail:13693378340@163.com)

Objective：To estimate the levels of cytokine release (interleukin-6, IL-6) and subsequent production of acute phase proteins (C-reactive protein, CRP and secretory phospholipase A2, sPLA2) in patients with hemodialysis (HD) and investigate whether the HD-induced acute phase reaction depends on the type of membrane or dialysate. Methodology：The levels of IL-6, CRP and sPLA2levels were assessed in blood samples drawn before, at the end and 24h after the start of HD in ten HD patients. All patients were dialysed on fibrin diacetate (FB) and Polysulphon (PS) dialysers, and 5 patients underwent an additional HD session on FB plus a dialysate filter (FBf). Results：The IL-6 levels in patients with FB and FBfwere increased significantly at the end of HD (P<0.05). After 24 h of HD, the IL-6 levels had returned to baseline, while it did not occur during HD with PS. At the end of HD, the IL-6 was significantly greater with FB and FBfdevices, than that with PS (P<0.05). The levels of CRP in patients with FB and FBfwasincreased significant after 24 h of HD, compared with postdialysis values (P<0.05). In addition, the levels of sPLA2were significantly increased after 24h of HD, compared with that at the end of HD (P<0.05). The IL-6 levels at t180were significantly correlated with the levels of CRP (r=0.67,P<0.01) and sPLA2(r=0.52,P<0.05) after 24h of HD. During HD with PS membranes, the CRP or sPLA2values were not significantly changed. Conclusion：In contrast to PS, both FB and FBfelevated serum IL-6 levels at the end of HD, which correlated with increased the levels of CRP and sPLA224h later. Therefore, the membrane types, rather than the bacterial quality of the dialysate, were responsible for the induction of the acute phase response during HD.

haemodialysis acute phase response C-reactive protein interleukin-6 secretory phospholipase A2

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAI10B08)；“十二五”全軍重大項(xiàng)目(AWS11J013)

北京市解放軍306醫(yī)院腎內(nèi)科(北京，100101)

韋加美(E-mail:13693378340@163.com)

2014-11-13

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