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    殼聚糖絮凝法精制川牛膝總多糖酶提取液的工藝研究

    2015-06-07 05:51:39劉傲霞夏玉婷谷旭晗
    機(jī)電信息 2015年29期
    關(guān)鍵詞:川牛膝去離子水絮凝劑

    成 悅 劉傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韓 偉

    (華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心,上海200237)

    殼聚糖絮凝法精制川牛膝總多糖酶提取液的工藝研究

    成 悅 劉傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韓 偉

    (華東理工大學(xué)中藥現(xiàn)代化工程中心,上海200237)

    以殼聚糖為絮凝劑對(duì)川牛膝的總多糖進(jìn)行了絮凝純化研究。通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)得到優(yōu)化的工藝條件為:絮凝溫度45℃、殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、絮凝時(shí)間2 h、藥液濃縮比1∶12、藥液pH=4。此時(shí),多糖保留率76.32%、脫蛋白率64.25%,與傳統(tǒng)醇沉工藝相比,絮凝法得到的多糖保留率和純度較高。

    殼聚糖;絮凝;川牛膝;總多糖;試劑

    0 引言

    川牛膝為莧科植物川牛膝(Cyathula officinaIis Kuan)的干燥根,為著名川產(chǎn)藥材,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、治療腰膝酸麻及肝陽(yáng)眩暈、散癖血、消腫痛等功效。川牛膝多糖是從川牛膝根中提取的一種生物活性多糖,相對(duì)分子質(zhì)量1 000~2 200,是高度分支的果聚糖。現(xiàn)代藥理研究表明,川牛膝多糖具有促進(jìn)紅細(xì)胞免疫、抗腫瘤、對(duì)抗環(huán)磷酰胺所致外周白細(xì)胞減少等療效。

    絮凝技術(shù)是一種簡(jiǎn)單有效的固液兩相體系分離方法,殼聚糖作為一種天然的鏈狀高分子絮凝劑,由葡萄糖胺通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成。由于分子中含有氨基,使殼聚糖在酸性條件下帶有正電荷,可發(fā)揮電中和與吸附架橋的雙重絮凝作用,并具有安全、無(wú)毒、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。

    本文以多糖保留率和脫蛋白率為指標(biāo),考察殼聚糖對(duì)川牛膝總多糖酶提取液的絮凝純化工藝,并通過(guò)數(shù)據(jù)分析優(yōu)化工藝參數(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 藥材

    川牛膝,產(chǎn)地為四川,購(gòu)于上海雷允上藥店。將川牛膝粉碎過(guò)篩成干粉后進(jìn)行預(yù)處理:用10倍量的體積分?jǐn)?shù)95%的工業(yè)乙醇回流1 h,冷卻至室溫,取上清液回收乙醇,烘干藥渣,裝袋于陰涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 主要試劑

    纖維素酶,上??笊锛夹g(shù)有限公司;95%工業(yè)乙醇;36%濃鹽酸、氫氧化鈉、5%苯酚溶液、98%濃硫酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純;葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品(>95%),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白和考馬斯亮藍(lán)G-250均為分析純,上海源聚生物科技有限公司;殼聚糖,上海偉康生物制品有限公司。

    1.1.3 主要儀器

    UV1900PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海亞研電子科技有限公司;pHS-2C數(shù)字式pH計(jì),上海雷磁儀器廠(chǎng);AL204分析天平,上海梅特勒-托利多儀器有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵,鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng);DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng);RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海予華儀器有限公司;RJ-TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī),無(wú)錫市瑞江分機(jī)儀器有限公司。

    1.2 樣品及試劑的制備

    1.2.1 樣品溶液的制備

    (1)藥材的預(yù)處理:將川牛膝粉碎過(guò)篩成干粉后進(jìn)行預(yù)處理,用10倍量的體積分?jǐn)?shù)95%的工業(yè)乙醇回流1 h,冷卻至室溫,回收乙醇,烘干藥渣,裝袋于陰涼處儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)樣品溶液的制備:稱(chēng)取20 g已處理的藥材和60 mg纖維素酶,置于500 mL的圓底燒瓶中;加入400 mL pH=5的去離子水,在45℃恒溫水浴鍋中酶解提取30 min,再用電熱套冷凝回流30 min,室溫冷卻15 min后,放入冷水中冷卻(敞口);冷卻至室溫后抽濾,收集濾液并量取其體積。

    1.2.2 試劑的制備

    (1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:精確稱(chēng)取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖50 mg,加去離子水溶解并定容至500 mL,即得0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    (2)質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液的制備:稱(chēng)取精制苯酚2.50 g,加去離子水溶液并定容至50 mL棕色容量瓶,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液。

    (3)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取20 mg結(jié)晶牛血清白蛋白,加水溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容,配制成0.20 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    (4)考馬斯亮藍(lán)G-250試劑的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg的考馬斯亮藍(lán)G-250,將其溶解于25 mL 95%的乙醇,再加入50mL85%的磷酸,加水定容至500mL。

    (5)殼聚糖絮凝劑的制備:取10 g醋酸(ρ=1.050,約為9.5 mL)置于600 mL大燒杯中,加入適量去離子水稀釋?zhuān)粶?zhǔn)確稱(chēng)取10.0 g殼聚糖,分批多次加入大燒杯中,攪拌至完全溶解,轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶,補(bǔ)充去離子水定容,即配制成1%的殼聚糖醋酸溶液,將其放置于冰箱內(nèi)2~3天充分溶脹后備用。

    1.3 分析方法的建立及計(jì)算

    1.3.1 川牛膝總多糖含量的測(cè)定

    精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL,分別置于25 mL具塞比色管中,補(bǔ)充去離子水至2.0 mL。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液1.0 mL,搖勻,迅速加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的H2SO45.0 mL,搖勻,室溫靜置30 min。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別在489 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得回歸方程為:A=12.040 48C-0.024 32,相關(guān)系數(shù)R=0.999 22。

    準(zhǔn)確移取2 mL樣品溶液,按相同的顯色操作,測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品溶液中總多糖的濃度及多糖保留率。

    1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

    分別稱(chēng)取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25 mL具塞比色管中,均補(bǔ)充去離子水至1.0 mL,各加入考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 mL,立即搖勻,室溫下靜置5 min,以1 mL去離子水作空白對(duì)照,于595 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度A為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo),繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得回歸方程為:A=5.680 8C-0.058 7,相關(guān)系數(shù)R=0.999 32。

    取樣品溶液1.0 mL,按相同的顯色操作,測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)的含量及脫蛋白率。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    移取一定濃縮比的藥液20 mL,在電磁攪拌狀態(tài)下,緩慢加入一定量的殼聚糖1%的醋酸溶液,水浴保溫?cái)嚢枰欢〞r(shí)間后取出,離心分離,取上清液測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)的含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 絮凝時(shí)間對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    圖1為絮凝時(shí)間對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響。可以看出,多糖保留率隨時(shí)間的增加而降低,在1.5~2 h范圍內(nèi)下降迅速,超過(guò)2 h后趨于穩(wěn)定;而脫蛋白率隨著時(shí)間的增加逐漸增大,并趨于穩(wěn)定,但絮凝時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)提高絮凝效果的作用不大,且多糖的損失會(huì)增加。

    圖1 絮凝時(shí)間對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    綜上,絮凝時(shí)間選取1.5 h為宜。

    2.2 濃縮比對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    藥液濃縮比對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響如圖2所示,可以看出,多糖保留率和脫蛋白率均隨著濃縮比的增大而增大,在稀釋到1∶10(g/mL)后,兩者均有下降趨勢(shì),且脫蛋白率的下降趨勢(shì)更為明顯。

    圖2 藥液濃縮比對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是,當(dāng)濃縮比合適時(shí),藥液能與絮凝劑充分結(jié)合,在分子間架橋并發(fā)揮絮凝作用。藥液濃度過(guò)小,溶液黏度較大,膠粒間距較小,不利于殼聚糖高分子鏈的分散,多糖易被包裹沉淀,造成多糖損失較大;藥液濃度過(guò)大,殼聚糖濃度降低,不利于絮凝劑分子與雜質(zhì)微粒的充分接觸,導(dǎo)致脫蛋白率降低。

    綜上,濃縮比選取1∶10為宜。

    2.3 溫度對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    圖3為絮凝溫度對(duì)純化結(jié)果的影響??梢园l(fā)現(xiàn),隨著絮凝溫度的增加,多糖保留率逐漸下降,而脫蛋白率先上升后下降,在溫度為45℃時(shí),脫蛋白率達(dá)到最高。這是因?yàn)闇囟壬?,分子熱運(yùn)動(dòng)較快,絮凝劑與雜質(zhì)分子的碰撞幾率增大,溶液在高溫下黏度加大,膠體顆粒結(jié)合成的絮凝體也增大,因此加速了絮凝。但溫度過(guò)高,易使絮凝劑分子老化,阻礙絮凝。

    圖3 絮凝溫度對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    綜上,確定絮凝溫度在45℃左右為宜。

    2.4 殼聚糖用量對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    殼聚糖用量對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響如圖4所示。隨著殼聚糖用量的增加,脫蛋白率增加,在0.8 mL/g后增加趨勢(shì)減緩,多糖保留率逐漸下降。這是因?yàn)闅ぞ厶菨舛容^低時(shí),絮凝劑分子與雜質(zhì)微粒的碰撞幾率小,進(jìn)行電中和與吸附架橋的作用弱,不利于絮凝作用的發(fā)揮;隨著殼聚糖用量增加,碰撞幾率增大,除雜效果提升,但不利于架橋作用,使多糖保留率降低。

    圖4 殼聚糖用量對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    綜上,殼聚糖用量選取0.4 mL/g為宜。

    2.5 溶液pH對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    圖5為pH值對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響??梢钥闯?,隨著藥液pH的升高,多糖保留率迅速下降,在pH為6之后趨于平穩(wěn),而脫蛋白率先迅速上升,后逐漸下降,在pH為4時(shí)脫蛋白率最高。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是,殼聚糖具有電中和與吸附交聯(lián)作用,當(dāng)pH較低時(shí),蛋白質(zhì)為陽(yáng)離子型,使殼聚糖電中和效果降低,脫蛋白率下降,同時(shí)多糖損失較多。當(dāng)溶液pH較高時(shí),體系中的負(fù)電荷增加,殼聚糖電中和負(fù)電荷增加,壓縮雙電層的效率降低,導(dǎo)致蛋白質(zhì)去除率也下降。

    圖5 溶液pH值對(duì)絮凝純化結(jié)果的影響

    綜上,選取溶液pH=4為宜。

    3 殼聚糖絮凝純化正交試驗(yàn)

    3.1 因素與水平的確定

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取對(duì)川牛膝多糖保留率及脫蛋白率影響較大的因素:殼聚糖用量(因素A)、濃縮比(因素B)、藥液pH(因素C)、絮凝時(shí)間(因素D),設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)表,結(jié)果如表1所示。

    表1 殼聚糖絮凝純化L9(34)因素水平表

    3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

    現(xiàn)以多糖保留率、脫蛋白率為評(píng)價(jià)指標(biāo),根據(jù)L9(34)正交設(shè)計(jì)開(kāi)展試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析如表2所示,多糖保留率與脫蛋白率的方差分析分別如表3、表4所示。

    由表2可知:

    (1)以多糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo),各因素對(duì)殼聚糖絮凝純化工藝的影響大小依次為:A>B>D>C,最佳工藝條為A1B3C1D2;表3的方差分析結(jié)果表明:殼聚糖用量、濃縮比、絮凝時(shí)間對(duì)多糖保留率均有顯著影響。

    (2)以脫蛋白率為評(píng)價(jià)指標(biāo),各因素對(duì)殼聚糖絮凝純化工藝的影響大小依次為:A>C>D>B,最佳工藝條件為A2B3C3D3;表4的方差分析結(jié)果表明:殼聚糖用量、藥液pH、絮凝時(shí)間對(duì)脫蛋白率的影響顯著。

    綜合上述分析結(jié)果,本研究主要根據(jù)脫蛋白率指標(biāo)優(yōu)選工藝條件,得到最佳工藝條件A2B3C3D3:殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、濃縮比為1∶12、藥液pH=5、絮凝時(shí)間為120 min,此時(shí)多糖保留率為76.32%、脫蛋白率為64.25%。

    表2 殼聚糖絮凝純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析表

    表4 脫蛋白率方差分析表

    4 結(jié)語(yǔ)

    (1)以多糖保留率和脫蛋白率為指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇濃縮比、絮凝時(shí)間、殼聚糖用量、藥液pH這4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),確定最優(yōu)的工藝條件為:殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、濃縮比為1∶12、溶劑pH=5、絮凝時(shí)間為120 min,此時(shí),多糖保留率為76.32%,脫蛋白率為64.25%。

    (2)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),確定各因素對(duì)多糖保留率影響大小的順序?yàn)椋簹ぞ厶怯昧浚緷饪s比>藥液pH>絮凝時(shí)間,其中殼聚糖用量、濃縮比、絮凝時(shí)間都為顯著影響因素;確定各因素對(duì)脫蛋白率影響大小的順序?yàn)椋簹ぞ厶怯昧浚舅幰簆H>絮凝時(shí)間>濃縮比,其中殼聚糖用量、藥液pH、絮凝時(shí)間都為顯著影響因素。

    [1]劉穎華.川牛膝多糖的制備、結(jié)構(gòu)解析及其體外抗病毒活性的研究[D].北京:中國(guó)科學(xué)院研究生院,2003.

    [2]劉傳敏,邵樂(lè),李金貴,等.酶解超聲法提取川牛膝多糖的正交試驗(yàn)研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2009,28(5).

    [3]成慶利.殼聚糖的結(jié)構(gòu)及抗菌作用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006,16(4).

    [4]F.Renault,B.Sancey,P.M.Badot,et al.Chitosan for coagulation/flocculation processes an ecofriendly approach[J].European Polymer Journal,2009(45).

    Study on the Flocculating Purification Process of Total Polysaccharides from Cyathula Officinalis Kuan by Using Chitosan

    Cheng Yue Liu Aoxia Xia Yuting Gu Xuhan Han Wei
    (Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)

    The essay was aimed at studying flocculating purification of total polysaccharides by using chitosan. The optimum conditions were obtained through single factor and orthogonal experiment.The results were as follows∶the temperature was 45℃,dosage of chitosan was 0.4 mL/g raw material,flocculation time was 2 h,solution concentration ratio was 1∶12,pH of solution was 4.Under this condition,polysaccharides retention rate was 76.32%, deproteinizing rate of 64.25%.Compared with the traditional alcohol precipitation process,the retention rate and purity of the polysaccharide of the flocculation purification process are higher.

    chitosan;flocculate;Cyathula officinalis Kuan;total polysaccharide;reagent

    2015-07-15

    成悅(1992—),女,寧夏銀川人,助理工程師,研究方向:制藥工程與技術(shù)。

    韓偉(1968—),男,江蘇揚(yáng)州人,博士,教授,從事中藥制藥工程、化工分離工程的研究工作。

    國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃,項(xiàng)目編號(hào):131025159;華東理工大學(xué)本科教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2013年)

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