袁 景,郭小玉,楊天溪,王 卉,傅書悅,李川川,孫傳文
(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)
基于光譜技術(shù)的食品中常見真菌毒素的快速檢測研究進展
袁 景,郭小玉,楊天溪,王 卉,傅書悅,李川川,孫傳文
(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234)
真菌毒素廣泛存在于食品中,特別是谷物和谷物制品,嚴重危害著人類和動物的安全和健康.隨著色譜技術(shù)、免疫化學(xué)以及光、電、聲等領(lǐng)域的不斷發(fā)展,檢測真菌毒素的方法出現(xiàn)多樣化,各種方法的優(yōu)缺點共存,如何快速、靈敏、準確、方便地進行檢測成為目前形勢發(fā)展下的要求.介紹了幾種真菌毒素的性質(zhì)、限量和檢測現(xiàn)狀,并綜述了基于拉曼光譜的真菌毒素檢測技術(shù),及其在不同真菌毒素檢測實驗中的應(yīng)用.
食品;真菌毒素;檢測;拉曼光譜技術(shù)
真菌毒素是指由真菌產(chǎn)生,對人和動物有毒的次級代謝產(chǎn)物.通常真菌感染正在生長或儲存的農(nóng)作物及其制品,導(dǎo)致真菌毒素的產(chǎn)生.2013年,據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計,全球每年大約有25%的糧食作物受到真菌毒素的污染[1].如果攝入,真菌毒素可以引起急性或慢性疾病發(fā)作,如致癌、致突變、致畸、生殖系統(tǒng)毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、出血性毒性、腎毒性、肝毒性和免疫抑制毒性等[2].不同的真菌可以產(chǎn)生多種真菌毒素,相同的真菌毒素也可以由不同的真菌產(chǎn)生.目前已知的真菌毒素有200多種,至少有100個國家已經(jīng)對糧食/飼料中真菌毒素的限量進行了規(guī)定.糧食中主要真菌毒素有黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin,OTA)、桔霉素(Citrinin,CIT)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)、伏馬毒素(fumonisin,F(xiàn)UM)等.關(guān)于真菌毒素的檢測方法多種多樣,各種方法優(yōu)缺點并存,比較常用的真菌毒素檢測方法主要有:
0.1 基于色譜與質(zhì)譜的方法
色譜技術(shù)是利用試樣中各組份在氣相和固定液液相間的分配系數(shù)及吸附或溶解能力的不同,按順序由色譜柱進入檢測器,在記錄器上描繪出各組份的色譜峰.質(zhì)譜技術(shù)是通過對樣品離子質(zhì)合比的分析來實現(xiàn)對樣品進行定性定量檢測的方法.例如,氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和各種質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)如氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等多種方法,上述幾種基于色譜和質(zhì)譜檢測技術(shù)的比較如表1所示[3].
0.2 基于免疫化學(xué)基礎(chǔ)的免疫分析方法
免疫學(xué)檢測方法是基于抗體與抗原或半抗原之間的選擇性反應(yīng)而建立起來的一種生物化學(xué)分析法.通常具有高的選擇性和很低的檢出限,在糧食及其制品真菌毒素檢測中應(yīng)用較廣的主要是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫層析法等.
表1 基于色譜與質(zhì)譜技術(shù)的GC、HPLC、GC/MS的比較
0.2.1 免疫膠體金技術(shù)
免疫膠體金技術(shù)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性,在金標蛋白結(jié)合處,顯微鏡下可見黑褐色顆粒.當這些標記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時,肉眼可以見紅色或粉紅色斑點,從而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法[4].2004年,美國農(nóng)業(yè)部糧食檢驗、肉類加工和活畜市場管理局(GIPSA)采用兩種快速定量試劑盒分別用于檢測伏馬毒素和嘔吐毒素,結(jié)果表明伏馬毒素試劑盒測試效果理想,而嘔吐毒素試劑盒沒有達到預(yù)期要求.同時進行的還有黃曲霉毒素試劑盒,不過當時仍處于數(shù)據(jù)驗證階段[5].2012年,賴衛(wèi)華等人利用免疫膠體金技術(shù)檢測到了醬油中黃曲霉素 B1,并且達到國家限量標準[6].
0.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)
酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種用過氧化物酶標記抗體,再與抗原結(jié)合,然后根據(jù)酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生溶性的有色物質(zhì),借助光學(xué)或電子顯微機觀察細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)中抗原物質(zhì)的方法.分為直接法和間接法[7].目前ELISA法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品中真菌毒素的檢測,例如,2012年,廖妍儼等[8]成功利用ELISA法檢測了牛奶中黃曲霉毒素M1.2006年,陳玲等[9]利用ELISA法檢測了飼料中的黃曲霉毒素.
0.3 生物傳感器技術(shù)
生物傳感器是將生物技術(shù)和電子技術(shù)相結(jié)合,以生物學(xué)組件作為主要功能性元件,能夠感受規(guī)定的被檢測物質(zhì)的量,并按照一定規(guī)律將其轉(zhuǎn)換成可識別信號的器件或裝置.該技術(shù)在黃曲霉素、伏馬毒素和雜色曲霉素的檢測中發(fā)揮了很好的作用[10].2005~2006年,Ngundi等人[11-12]先后利用生物傳感器成功地檢測了谷物中的赭曲毒素和嘔吐毒素,并取得了良好效果.
0.4 近紅外技術(shù)
近紅外光是指介于可見光和中紅外光之間的電磁波,波長范圍是700~2 500 nm,一般有機物在該區(qū)的近紅外光譜吸收主要是含氫基團(OH,NH2,SH)等的倍頻和合頻吸收[13].2012年,Dall′Asta等人[14]借助近紅外光譜,研究了玉米樣品的各成分比例,由于受到高污染的樣品亞油酸成分較高,成功檢測到了玉米樣品中伏馬霉素的存在.上述幾種測技術(shù)的比較如表2[3]所示.
表2 免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感器技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)的比較
拉曼光譜相關(guān)技術(shù)是基于化學(xué)鍵的極化率,較其他技術(shù)對分子非極性基團中共價鍵的對稱振動更為敏感,操作簡單、無損、快速、便攜、重復(fù)性、靈敏度高、不受水分子等干擾、很少有重疊帶,可以為定性和定量檢測真菌毒素的化學(xué)官能團及其衍生物提供更多有價值的信息.本文作者主要介紹基于拉曼光譜的幾種真菌毒素的檢測技術(shù).
常規(guī)的拉曼光譜有時存在局限性,即靈敏度低,信號較熒光顯微鏡要弱很多.因此,常規(guī)的拉曼光譜技術(shù)通過將被檢測的物質(zhì)吸附在粗糙的納米金屬表面,通常是金、銀、銅或者一些不常用的堿金屬(鋰、鈉)[15],從而增強108數(shù)量級的信號強度,常認為表面等離子共振產(chǎn)生的表面電磁場增強和電荷轉(zhuǎn)移引起的化學(xué)增強是導(dǎo)致拉曼散射信號極大增強的兩種主要原因,這種方法稱為表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS).與拉曼技術(shù)相關(guān)的混合動力系統(tǒng)光譜還有很多類型,例如:表面增強共振拉曼光譜(surface-enhanced resonance Raman spectroscopy,SERRS),傅里葉近紅外表面增強拉曼光譜(FT near-IR-SERS),表面增強拉曼散射—掃面近場光學(xué)顯微鏡(SERS-SNOM),針尖增強拉曼光譜(tip-enhanced Raman spectroscopy,TERS)等[16].
黃曲霉毒素是最強的化學(xué)致癌物之一,主要存在于玉米、花生等糧食中,它能使人體或動物的免疫功能喪失,誘導(dǎo)畸形、癌癥的發(fā)生.黃曲霉毒素的毒性主要是對肝臟的損害,導(dǎo)致肝癌,還可以誘發(fā)骨癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌等,對人類、家畜和家禽的健康產(chǎn)生了嚴重的危害,其“三致”(致突變、致癌、致畸性)危害性已引起了世界的關(guān)注.1993年國際癌癥研究所將黃曲霉毒素確定為一級人類致癌物,現(xiàn)已有60多個國家制訂了食品和飼料中黃曲霉毒素限量標準和法規(guī)[17].我國對食品中黃曲霉毒素B1的最高允許量為玉米、花生及其制品20μg/kg;大米、食用油類10μg/kg;其他糧食、豆類、發(fā)酵食品5μg/kg;并規(guī)定嬰兒食品不得檢出[18-19].國際食品法典規(guī)定食品中黃曲霉素最高允許量為15μg/kg[20].
在以往的文獻中已有基于拉曼相關(guān)技術(shù)檢測黃曲霉毒素的報道.2014年,Lee等人[21],利用從德克薩斯州取來的132個已經(jīng)接種過黃曲霉毒素的玉米樣品,每個樣品4.5 kg,濃度范圍分別在0~1 206μg/kg,通過樣品打碎、干燥等一系列方法預(yù)處理,至于拉曼顯微鏡下,進行2 s 5次,200~3 500 cm范圍內(nèi)掃描,得出光譜數(shù)據(jù)取平均值.通過求導(dǎo)和計算,經(jīng)對光譜數(shù)據(jù)作定性和定量分析后得出400~620 cm-1,750~ 1 200 cm-1,1 400~1 800 cm-1幾個范圍內(nèi)的波峰與玉米樣品中的黃曲霉毒素有密切關(guān)系.同年,Lee等人[22]又利用與上述相同條件下被污染的玉米樣品,用甲醇萃取后,至于拉曼顯微鏡觀察,得到了5個不同濃度的黃曲霉毒素拉曼光譜,從而驗證了拉曼光譜檢測黃曲霉素的可行性.2012年,Wu等人[23]利用電子束斜角沉積的方法制得銀納米棒作為基底,通過拉曼顯微鏡,在激發(fā)波長為785 nm條件下,也檢測出了甲醇溶液中不同濃度的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,其中各黃曲霉毒素在甲醇溶液中的最低檢出限為AFB1:5×10-5mol/L;AFB2:1×10-4mol/L;AFG1和AFG2:5×10-6mol/L.同時進行了密度泛函理論的計算,對各黃曲霉毒素的拉曼光譜進行了進一步的分析.2014年,Ivanova和Spiteller等人[24],分別用拉曼光譜和質(zhì)譜檢測了黃曲霉毒素B1、G1、M1、B2A、G2A、M2A.其中拉曼光譜的檢出限為10.13μg/kg,定量限為33.76μg/kg.2012年,高思敏、王紅艷等[25]采用密度泛函理論(DFT)的B3LYP方法和6-311g(d,p)(C,H,O)/LanL2DZ(Ag)基組,優(yōu)化得到黃曲霉毒素分子AFB1與不同尺寸Ag小團簇形成的復(fù)合物AFB1-Ag n穩(wěn)定結(jié)構(gòu),并計算了3種復(fù)合物的表面增強拉曼光譜(SERS)和預(yù)共振拉曼光譜(SERRS),與文獻中實驗結(jié)果相一致.
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又稱為嘔吐毒素、致嘔毒素,一般在小麥、玉米中含量較高,在大米和黑麥中的含量相對較低.嘔吐毒素的高細胞毒性及免疫抑制性質(zhì),已對人類及動物的健康構(gòu)成了威脅.在實驗動物模型中,急性中毒引起嘔吐,而慢性低劑量暴露引起厭食、生長遲緩、免疫毒性以及生殖與發(fā)育障礙.在細胞水平上,可以破壞生物大分子合成、影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分化和增殖以及凋亡[26].我國國家標準規(guī)定小麥、面粉、玉米及玉米粉中DON的限量為1 000μg/kg[27].國際上限量標準最高的為美國,規(guī)定人類食用磨粉小麥的最高限量為2 mg/kg;飼料用小麥及其制品最高允許量為4 mg/kg[17].
2009年,Liu等人[28]利用傅里葉拉曼顯微鏡對受到DON污染的大麥和小麥進行了探究.他們選用受到不同濃度DON污染的大麥、小麥各16組樣品,首先打碎,一部分通過萃取,凈化柱過濾,進行氣相色譜-質(zhì)譜分析;另一部分放置于傅里葉拉曼顯微鏡下進行受感染固體粉末拉曼光譜測量,并對所得光譜數(shù)據(jù)進行了取平均值和主成分分析,得到了被污染大麥和小麥在DON含量在0、5、10、31 mg/kg 4個條件下的拉曼光譜圖(圖2)和DON含量在0、6、10、33 mg/kg 4個條件下的拉曼光譜圖(圖1),并加以作圖分析.
圖1 濃度范圍在0、6、10、33 mg/kg,受DON污染大麥的FT-拉曼圖[28]
圖2 濃度范圍在0、5、10、31 mg/kg,受DON污染大麥的FT-拉曼圖[28]
赭曲霉毒素包括赭曲霉毒素A、B、C、D,其中毒性最強的是赭曲霉毒素A(OTA),主要以腎臟毒性為主,另外還具有肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)毒性,以及致癌、致突變、致胎兒畸形的作用[29].赭曲霉毒素主要存在于糧食和谷物類、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料、罐頭食品、油、橄欖、豆制品、啤酒、茶葉等多種農(nóng)作物和食品中,在動物飼料中OTA的污染也非常嚴重.我國規(guī)定人類糧食谷物、豆類及其制品中限量是5μg/kg[30].對實驗動物的半數(shù)致死劑量(LD50)依給藥途徑、實驗動物種類和品系不同而異,經(jīng)口染毒OTA對豬的LD50為1 mg/kg、狗為0.2 mg/kg、雞為3.3 mg/kg,大小鼠依品系不同而異[31].國際上具有最高允許量的國家為以色列,谷類、豆類的最高限量為0.05 mg/kg;飼料用谷物為0.3 mg/kg[23].
目前,基于赭曲霉毒素A的拉曼檢測常與適配體技術(shù)結(jié)合.適配體又稱適體,是一類25~80個堿基組成的寡聚DNA或RNA分子,是通過一種新型的組合化學(xué)技術(shù):鄄指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術(shù),經(jīng)體外篩選得到的[32],其特殊而穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu),可以通過空間構(gòu)型互補高親和力、高異特性與不同靶物質(zhì)結(jié)合.目前已經(jīng)篩選出針對赭曲霉毒素的適配體序列,并且對其5′端進行了修飾待實驗使用[32]. 2014年,Ganbold等人分別從sigma和Bioneer公司買來OTA分子和相應(yīng)被修飾的適配體序列,單純地在帶有該適配體的銀基底上加入OTA分子,采用了與拉曼光譜技術(shù)結(jié)合的方式檢測到了赭曲霉毒素A的存在,未結(jié)合OTA的適配體序列可以很容易吸附在銀納米粒子表面并且產(chǎn)生很強烈的SERS信號,當赭曲霉毒素A含量逐漸增加,由適配體產(chǎn)生的SERS信號就會下降約40%,這是因為適配體與OTA分子結(jié)合,構(gòu)型發(fā)生了改變,從而不能和銀納米粒子表面結(jié)合.從未結(jié)合QTA的適配體到結(jié)合了靶分子OTA的適配體,可以從SERS光譜圖出峰的改變觀察到.通過這種間接方法成功的檢測到了濃度范圍在0.1~10 nmol/L內(nèi)的OTA存在[33].2013年,Betty等人用適配體與拉曼結(jié)合檢測了OTA的銀基底上的存在,與之前不同的是,他們使用了嵌有金納米粒子的微流通道,保證了待測溶液流動的準確和微量,并且適配體5′端被巰基標記,同樣,沒有結(jié)合OTA的適配體為卷曲構(gòu)型,與金納米粒子結(jié)合產(chǎn)生一定的SERS信號,當適配體與靶分子OTA赭曲毒素A結(jié)合后變成了四倍體鳥苷構(gòu)型,從而SERS光譜發(fā)生了改變[34].
桔霉素是一類具有熒光性的醌類甲基化合物,它是霉菌代謝產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,也可以由一些青霉、曲霉屬真菌產(chǎn)生.桔霉素具有肝毒性、生殖毒性、誘導(dǎo)細胞畸變和凋亡[35].桔霉素也具有明顯腎毒性,可引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀[36].桔霉素對植物及草也有毒性作用,從毒性上來說,桔霉素與黃曲霉毒素(如黃曲霉毒素B1在紅曲米中的指標為5×10-6mol/L)可相提并論[37].目前在世界各地的多種農(nóng)產(chǎn)品、食品、紅曲制品、飼料中均已被檢出.
Singh等人利用銀納米粒子作為SERS基地,通過標準加樣法成功檢測了桔霉素在各類基底上的.實驗首先制得銀納米粒子,并且配制10-2mol/L的于乙醇中的桔霉素儲存液,再將二者按照一定比例混合,稍加聚合,至于激光為633 nm的拉曼顯微鏡觀察,曝光時間30 s,得出光譜數(shù)據(jù),檢出限測為10-6mol/L.之后又將桔霉素的密度泛函理論光譜、常規(guī)拉曼光譜、位于銀板、位于聚四氟乙烯膜、10-5mol/L和10-6mol/L濃度位于銀納米粒子上的SERS光譜進行了總結(jié)比較[38].比較結(jié)果如圖3所示.
圖3 (a)對位甲基奎寧的DFT計算光譜;(b)桔霉素的普通拉曼光譜圖;(c)桔霉素在銀板上的拉曼光譜圖;(d)桔霉素聚四氟乙烯薄膜上的拉曼光譜圖;(e)10-5mol/L桔霉素于銀納米粒子上的拉曼光譜圖;(f)10-6mol/L桔霉素于銀納米粒子上的拉曼光譜圖;(g)銀納米粒子基底的拉曼光譜圖[38]
伏馬菌素是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物.目前發(fā)現(xiàn)種類已有FA1、FA2、FBl、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FP1共11種,其中FB是其主要組分,占總量的70%,同時也是導(dǎo)致伏馬菌素毒性作用的主要成分,伏馬菌素能夠廣泛污染糧食及其制品,如玉米片、牛奶、茶、啤酒等,其中玉米及其制品最為嚴重,該毒素對某些家畜產(chǎn)生急性毒性并有潛在的致癌性,同時具有神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝臟,腎臟、肺毒性[39].對于伏馬毒素的研究很多,但對其制定限量標準的很少.2001年6月美國食品與藥物管理局(FDA)規(guī)定人類食用玉米中伏馬毒素最高限量為2 mg/kg;同時,F(xiàn)DA的畜牧醫(yī)學(xué)中心(CVM)也發(fā)布了動物飼料中伏馬毒素的最高限量指導(dǎo)性公告,規(guī)定其限量范圍為1~50 mg/kg.歐盟監(jiān)管當局目前也正在討論有關(guān)伏馬菌素法規(guī)性限量的制定問題[23].
Lee等人[40]選用來自德克薩斯州試驗田,已經(jīng)受到濃度范圍在2.0~99.0 mg/kg的伏馬毒素污染的100組玉米樣品為實驗對象,經(jīng)過打碎、干燥、控溫等一系列樣品處理方式,最終至于近紅外激發(fā)波長為785 nm的拉曼顯微鏡下進行2 s 3次掃描測量,光譜范圍設(shè)定為200~3 500 cm-1,得到光譜數(shù)據(jù)并加以求導(dǎo)和分析,從而評估了利用拉曼光譜技術(shù)檢測伏馬毒素的可行性,拉曼光譜如圖4所示.圖4為未經(jīng)求導(dǎo)處理前5~25 mg/kg、25~50 mg/kg、50~100 mg/kg受FUM污染玉米的拉曼光譜圖.
圖4 5~25、25~50、50~100 mg/kg受伏馬毒素污染的玉米常規(guī)拉曼光譜圖
真菌毒素種類眾多,在世界范圍內(nèi)普遍污染各種糧食、食品及飼料,其毒性可以嚴重危害人類和動物的健康和安全,造成食品的浪費.以往多種檢測真菌毒素的方法,基于便攜、簡單、快速、準確、操作簡單地檢測食品中真菌毒素的多方面綜合考慮,這些或多或少存在不足.如何快速、便攜、準確、靈敏地進一步實時檢測操作,已經(jīng)成為人們在檢測真菌毒素道路上的目的與追求.表面增強拉曼光譜技術(shù)在幾種真菌毒素的檢測中已經(jīng)有涉及,并取得了良好的效果,但還沒有普遍使用,是一個新興的思路和探究方向,具有很高的研究價值,其可以無損、快捷,無污染、低干擾、快速準確地應(yīng)用到實際生活的各類檢測中,在食品中真菌毒素的檢測領(lǐng)域有著鮮明的優(yōu)勢.研究者可以探索研制新型高效的表面增強拉曼光譜基底,或?qū)⒗庾V技術(shù)與其他技術(shù)材料配合使用,進一步提高檢測準確度和靈敏度,推動基于拉曼光譜技術(shù)的真菌毒素檢測技術(shù)在食品安全中發(fā)揮更顯著的作用,另外,拉曼光譜技術(shù)在食品、生物、化學(xué)、環(huán)境、醫(yī)藥等方面也有很好的應(yīng)用前景,值得進一步探索、實踐和應(yīng)用.
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Advances in rapid detection of common m ycotoxins in food based on spectral technology
YUAN Jing,GUO Xiaoyu,YANG Tianxi,WANG Hui,F(xiàn)U Shuyue,LIChuanchuan,SUN Chuanwen(College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai200234,China)
Mycotoxins are widely present in foods,espacially in cereals and cereal products.It does serious harms to the safety and health of humans and animals.With the development of chromatographic techniques,immunochemical,spectroscopy,electricity and other areas,themethods to detect the presence ofmycotoxins have been diversified.However,all thesemethods have both advantages and disadvantages under the current situation,as a result,how to detectmycotoxins fastly,sensitively,accurately and conveniently turns out to be highly desirable.This review introduces severalmycotoxins,as well as their limit standards and the present situations ofmycotoxin detection.An optical based technique named Raman and its applications in detecting differentmycotoxin have also been described.
food;mycotoxin;detection;Raman spectral technology
Q 331
A
1000-5137(2015)05-0571-08
(責(zé)任編輯:顧浩然)
10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.05.019
2014-08-16
上海師范大學(xué)創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃(DXL123);主任基金(C-6101-10-038)
孫傳文,中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號,上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,郵編:200234,E-mail:willin@shnu.edu.cn