控制水稻紅米性狀相關(guān)基因分子標記的開發(fā)

張亭亭，竇蘭蘭，王英存，李建粵

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

控制水稻紅米性狀相關(guān)基因分子標記的開發(fā)

張亭亭，竇蘭蘭，王英存，李建粵

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234）

紅米因其獨特的營養(yǎng)價值日益受到人們關(guān)注.紅米由兩對非同源染色體上的Rc、Rd顯性基因控制，且Rc、Rd基因同時存在時，水稻才表現(xiàn)為紅米表型.本研究分別在Rc和rc等位基因以及Rd和rd等位基因影響性狀的關(guān)鍵性位點上建立了分子標記：Rc（+5150）和Rd（+276）.檢測結(jié)果顯示：這2個分子標記可以分別用來區(qū)別控制紅米性狀的Rc/rc和Rd/ rd基因型.開展本研究，為今后利用分子標記輔助快速有效地選育各類紅米水稻新品種研究提供了重要的幫助.

水稻；分子標記；紅米；Rc基因；Rd基因

隨著生活水平的提高，目前人們對稻米的需求已不僅僅滿足于解決溫飽問題，同時希望吃得更營養(yǎng)更健康.在天然有色水稻糙米中，如紅米表皮，含有類黃酮中的重要成員，花色素與糖基結(jié)合形成的花色苷.

類黃酮作為一類天然生物活性物質(zhì)對人體具有多種保健功效，其在增強人體免疫力以及防治多種慢性病等方面的作用越來越受到人們的重視.早在2000年，Middleton等報道［1］，黃酮類物質(zhì)對抵制哺乳動物細胞炎癥、心臟病以及癌癥方面有較好的效果.黃酮類物質(zhì)還具有抗氧化、降低血清膽固醇和血清脂質(zhì)、抑制癌細胞生長和抗癌等生理功能［2-3］.黃酮類食物的攝取可以降低由冠心病、心血管疾病和其他原因?qū)е氯说乃劳鑫ｋU［4］.McCullough等［5］的研究表明，即使攝入極少量黃酮類富集的食物對人體也大有裨益.

紅米的米色由兩對基因，Rc和Rd決定.這兩對基因都通過單基因進行遺傳，但同時又具有相互作用，共同參與水稻谷粒種皮中紅色色素的淀積.Rc基因編碼一個含有bHLH基序的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，Rd基因編碼花色素合成路徑中一個關(guān)鍵分子DFR蛋白.當Rc單獨存在，即基因型為RcRcrdrd或Rcrcrdrd的水稻，米色為棕色.當Rd單獨存在時，即基因型為rcrcRdRd或rcrcRdrd的水稻，米色為白色.當Rc和Rd兩對基因都隱性純合時，即基因型為rcrcrdrd，米色也為白色.絕大多數(shù)白米水稻都是rcrcrdrd基因型.只有當Rc和Rd同時存在，即基因型為Rc-Rd-，米色才能表現(xiàn)為紅色［6-7］.

本文作者根據(jù)Rc和Rd分別在紅米和白米中的差異位點，建立了便于檢測Rc和Rd兩對等位基因的分子標記.開展本研究，可為利用分子標記輔助選育紅米水稻新品種研究奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 水稻材料和總DNA提取

本試驗用到4種水稻種子：“Kasalath”（基因型為RcRcRdRd）紅米水稻種子、“日本晴”（基因型為rcrcrdrd）白米水稻種子、“上師大6號”（基因型為RcRcRdRd）紅米水稻［8］與“上師大5號”（基因型為rcrcrdrd）白米巨胚水稻［9］雜交種子以及再自交收獲的種子.分別在如上4種水稻種子長出幼苗后取葉片，采用CTAB法提取基因組DNA.

1.2 分子標記的建立與檢測

比較從GenBank查找的“Kasalath”水稻（GenBank：AB250059.1）和“日本晴”水稻（GenBank：DQ885804.1）相應(yīng)的Rc和rc等位基因序列.在Rc和rc兩者具有差異位點的兩端設(shè)計1對引物.Rc和rc等位基因的PCR檢測反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s、59℃退火30 s、72℃延伸20 s，32個循環(huán)；72℃保溫10 min.

從GenBank查找“Murasaki-ine”水稻（AB003495）［7］的Rd序列，再通過NCBI的blast尋找“日本晴”相應(yīng)序列（AP004317.1）并進行比較.在兩者有差異位點的兩端設(shè)計一對引物.Rd和rd等位基因擴增的PCR程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30s、64℃退火30 s、72℃延伸40 s，32個循環(huán)；72℃保溫10 min.

各引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

對于Rc和rc等位基因擴增產(chǎn)物，直接采用4%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.Rd和rd等位基因擴增產(chǎn)物，需要進一步采用Taq I限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，再利用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.Rd和rd等位基因擴增產(chǎn)物酶切體系：PCR產(chǎn)物17μL，Taq I內(nèi)切酶（TaKaRa公司）1μL（10U），10×Taq IBuffer 2μL，0.1%BSA 2μL，在65℃水浴鍋中酶切12 h.

2 結(jié)果與分析

2.1 Rc和Rd基因分子標記的建立

比較白米水稻“日本晴”rc基因和紅米水稻“Kasalath”Rc基因包括外顯子和內(nèi)含子全長序列發(fā)現(xiàn)，不論在外顯子和內(nèi)含子，兩者都存在差異.在第7外顯子，距離Rc基因起始密碼子第一個脫氧核苷酸+ 5150處，“日本晴”的rc基因比“Kasalath”Rc基因缺失14個脫氧核苷酸（圖1）.

根據(jù)Furukawa等研究認為，正是由于這14個脫氧核苷酸的缺失引起Rc基因移碼突變，提前出現(xiàn)終止密碼子，導致白米水稻的rc基因合成的是一個無功能的截短蛋白［7］.因此，本試驗將Rc和rc等位基因在第7外顯子是否具有14個脫氧核苷酸缺失位點作為篩選Rc/rc的分子標記Rc（+5150），并在其兩端設(shè)計一對上、下游引物Rc-F和Rc-R，相應(yīng)的序列分別為：5′CAGTTACAGGGGAGCAGAAAC3′和5′GTACCAAAGATCGCAGAATTATG3′.

比較“日本晴”水稻rd基因和“Murasaki-ine”水稻Rd基因包括外顯子和內(nèi)含子全長序列發(fā)現(xiàn)，兩者只有一個脫氧核苷酸位點差異.在距離Rd基因起始密碼子第一個脫氧核苷酸+276處，“Murasaki-ine”水稻的Rd基因為C，與臨近上游+275處脫氧核苷酸T和臨近下游+277和+278兩處脫氧核苷酸G和A，構(gòu)成Taq I限制性核酸內(nèi)切酶識別位點“TCGA”，而白米水稻rd基因+276處脫氧核苷酸為A，不能被Taq I限制性核酸內(nèi)切酶識別（圖2）.本試驗將該位點作為篩選Rd/rd的分子標記Rd（+276），并在兩端設(shè)計一對上、下游引物Rd-F和Rd-R，相應(yīng)的序列分別為：5′ATGGGCGAGGCGGTGAAGG3′和5′TCGTCGTGGTCGTAGGAGGG3′.

圖1 ＂Kasalath＂和＂日本晴＂水稻部分Rc和rc等位基因序列比較（陰影部分顯示為差異位點）

圖2 ＂Murasakiine＂和＂日本晴＂水稻部分Rd和rd等位基因序列比較（陰影部分顯示為差異位點）

2.2 Rc和Rd基因分子標記的檢測

利用Rc-F和Rc-R一對引物，對分別含有Rc和rc等位基因的“Kasalath”和“日本晴”水稻基因組DNA進行擴增，預(yù)計兩種水稻都只能擴增出一條帶，分子量分別為167 bp和153 bp，而雜交植株同時具有與“Kasalath”和“日本晴”兩種水稻相同分子量的兩條帶.經(jīng)檢測顯示，電泳結(jié)果與預(yù)計完全相同（圖3A）.由此表明，本試驗設(shè)計的分子標記及檢測方法能夠明顯地區(qū)分出紅米水稻和白米水稻分別具有的Rc和rc等位基因.

圖3 Rc（A）和Rd（B）基因分子標記檢測

Rd和rd基因PCR產(chǎn)物預(yù)期都為553 bp.Rd基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)Taq I限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，預(yù)計會產(chǎn)生分子量分別為275、52、57、132和37 bp 5個片段.由于52 bp和57 bp條帶比較接近，預(yù)計用2%的瓊脂糖凝膠電泳往往會分不開，37 bp條帶片段較小，電泳后在凝膠中有可能會看不到；rd基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)Taq I限制性核酸內(nèi)切酶酶切后，預(yù)計會產(chǎn)生分子量分別為327、57、132和37 bp 4個片段.因此，Rd和rd基因PCR產(chǎn)物經(jīng)Taq I限制性核酸內(nèi)切酶酶切，再經(jīng)過2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，兩者之間的主要差異是在275 bp和327 bp兩個條帶.

以“Kasalath”紅米水稻、“日本晴”白米水稻以及紅米和白米雜合植株為材料，對本試驗設(shè)計的Rd基因分子標記及相應(yīng)的Rd-F和Rd-R引物和檢測方法進行驗證.結(jié)果顯示，“Kasalath”水稻的PCR產(chǎn)物經(jīng)Taq I酶切后具有275 bp的特征條帶（圖3B泳道1），“日本晴”水稻的PCR產(chǎn)物經(jīng)Taq I酶切后具有327 bp的特征條帶（圖3B泳道2），而雜合植株同時具有275 bp和327 bp的特征條帶（圖3B泳道3）.因此，本試驗設(shè)計的分子標記及檢測方法能夠明顯地區(qū)分出紅米水稻和白米水稻分別具有的Rd和rd等位基因.

2.3 Rc和Rd基因分子標記對F2植株的檢測

以“Kasalath”和“日本晴”水稻為對照，利用Rc和Rd基因分子標記，檢測了124棵由“上師大6號”紅米水稻［8］與“上師大5號”白米巨胚水稻［9］雜交再自交獲得F2植株的基因型.在F2植株中，如Rc或Rd帶型與“Kasalath”水稻相同，表明該植株具有純合顯性的Rc或Rd基因，如帶型與“日本晴”水稻相同，表明該植株具有純合隱性的rc或rd基因，如帶型同時具有與“Kasalath”和“日本晴”相同條帶，表明該植株的Rc或Rd基因為雜合狀態(tài)（圖4A、B）.在124棵自交植株中，對于Rc/rc等位基因，篩選到三種帶型植株數(shù)分別為：33∶58∶33；對于Rd/rd等位基因，篩選到三種帶型植株數(shù)分別為：36∶54∶34.經(jīng)χ2檢測顯示，Rc基因和Rd基因的分離比，都符合孟德爾一對基因F2植株基因型1∶2∶1的分離比.根據(jù)孟德爾的分離規(guī)律和自由組合規(guī)律，兩對基因F2代植株對應(yīng)4種表型（Rc-Rd-、rcrcRd-、Rc-rdrd、rcrcrdrd）的分離比為9∶3∶3∶1.從分子標記檢測顯示，4種表型對應(yīng)的基因型實際觀察值為67∶24∶24∶9.χ2檢測顯示，實際值與理論值也相符.

圖4 部分F2植株Rc（A）和Rd（B）基因檢測

對應(yīng)比較Rc和Rd兩個基因的檢測結(jié)果，本試驗共篩選到9棵與純合紅米水稻品種完全相同基因型的植株.

3 討 論

在水稻傳統(tǒng)育種中，主要根據(jù)田間表型對植株進行篩選.由于表型往往受到季節(jié)、環(huán)境及基因表達與否的影響，以至于個體的表型有可能與其基因型之間存在較大的差異.而且，有些性狀，如米色的表型，由于存在母性效應(yīng)而延遲至下一代才會與基因型一致.所以在水稻常規(guī)育種中，通過表型進行篩選，準確性相對較差.分子標記輔助育種選擇，是利用分子標記對目標基因進行篩選［10］.由于直接針對DNA分子水平上的差異進行篩選，因此，分子標記輔助育種選擇，不受環(huán)境和目標基因表達的影響，可提高篩選的準確率，還能夠縮短育種年限；在另一方面，由于沒有引入異源基因，不存在目前爭議較大的轉(zhuǎn)基因安全問題［11］.

最近幾年，利用分子標記輔助選育水稻新品種研究越來越受到育種家的重視，并在水稻分子標記開發(fā)［12-15］、水稻食味品質(zhì)改良［8，16］、提高水稻的抗病性［8］、培育香型巨胚水稻［17］等方面已有較多研究報道.紅米水稻因其糙米表面含有對人體具有保健功能的黃酮類物質(zhì)，屬于特種功能水稻.盡管目前已有關(guān)于控制紅米性狀基因相關(guān)的研究報道［6-7］，但至今為止國內(nèi)外還未見關(guān)于控制紅米性狀相關(guān)基因分子標記開發(fā)方面的研究報道.

在目標基因編碼序列與決定性狀直接相關(guān)的位點上建立分子標記，是針對目標基因篩選最為有效的標記類型.本研究建立的紅米性狀篩選的兩個分子標記，都是直接涉及兩個目標基因的關(guān)鍵性位點.在本研究中，已利用這樣的分子標記篩選獲得了Rd和Rc基因都顯性純合的植株，再結(jié)合常規(guī)育種對純合植株進行田間農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀觀察和篩選，即可快速培育出紅米水稻新品種.

雖然紅米的營養(yǎng)成分含量比普通白米高，但目前采用常規(guī)育種培育的紅米水稻產(chǎn)量一般比普通白米水稻低.紅米性狀來源于野生稻，以常規(guī)育種選育的紅米水稻，其口味一般不如普通栽培稻.如果將本研究建立的分子標記在育種中加以應(yīng)用，同時結(jié)合前人在稻米優(yōu)質(zhì)食味品質(zhì)、抗病、香味等性狀建立的分子標記，一同進行輔助選擇，并以高產(chǎn)水稻品種作為回交親本，就有望選育出產(chǎn)量高、口味優(yōu)良的紅米水稻新品種.

Megan等［18］通過比對紅米“O.rufipogon”與白米“Jefferson”的Rc/rc等位基因發(fā)現(xiàn)，外顯子單核苷酸差異位點有8處，還有2處片段的缺失和1處片段插入.Furukawa等也發(fā)現(xiàn)紅米“Kasalath”水稻和白米“日本晴”水稻，在Rc基因除了單核苷酸堿基差異外，第7外顯子處有14個核苷酸缺失，第8外顯子有12個核苷酸的缺失和6個核苷酸插入［7］.比較白米“日本晴”水稻rd基因和“Murasaki-ine”水稻的Rd基因包括外顯子和內(nèi)含子全長序列顯示，兩者只有一個核苷酸的堿基位點差異.從進化的角度考慮，對于共同控制水稻紅米性狀的兩個互作基因，Rd比Rc保守.

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Development of themolecular markers for identifying red pericarp trait in rice

ZHANG Tingting，DOU Lanlan，WANG Yingcun，LIJianyue
（College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai200234，China）

Red rice attracts people′s attention greatly for its special nutritional value.Red pericarp phenotype of rice is controlled by two pairs of dominant genes，Rc and Rd，on non-homologous chromosomes，and rice pericarp will be red only while Rc and Rd genes are both present.In this study we developed twomolecularmarkers，namely Rc（+5150）and Rd（+276），directly on key loci of Rc/rc allele and Rd/rd allele affecting the rice pericarp color.The results show that the twomolecularmarkers could discriminate the different genotypes of Rc/rc and Rd/rd.This study provides an important help for breeding red rice new varieties quickly and efficiently by usingmolecularmarker-assisted selection.

rice；molecularmarker；red pericarp rice；Rc gene；Rd gene

Q 341；S 336

A

1000-5137（2015）05-0485-05

（責任編輯：顧浩然）

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.05.005

2014-07-26

上海師范大學產(chǎn)學研項目（DCL201103）

李建粵，中國上海市徐匯區(qū)桂林路100號，上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，植物種質(zhì)資源開發(fā)中心，郵編：200234，E-mail：lijianyue01@aliyun.com