蘇云金芽孢桿菌BtZ01對小鼠胚胎和胚后發(fā)育的影響

陳波，谷明娟，朱遙，劉勇亮，潘康成

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物微生態(tài)研究中心，雅安 625014

蘇云金芽孢桿菌BtZ01對小鼠胚胎和胚后發(fā)育的影響

陳波，谷明娟，朱遙，劉勇亮，潘康成*

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物微生態(tài)研究中心，雅安 625014

為了探討蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis， Bt) BtZ01對小鼠胚胎發(fā)育和胚后生長發(fā)育的影響，將48只孕鼠隨機(jī)分組，試驗(yàn)組飼喂?jié)舛确謩e為106CFU·mL-1、 108CFU·mL-1、 5×109CFU·mL-1的BtZ01菌液，并設(shè)滅菌水為對照組。采用行為致畸學(xué)方法檢查BtZ01對小鼠胚胎和胚后發(fā)育的影響并制作臟器切片，測量臟器指數(shù)等指標(biāo)。結(jié)果表明，與對照組相比，各試驗(yàn)組小鼠在胚胎和胚后發(fā)育各階段體重和體長無顯著差異(P>0.05)，胚胎畸形發(fā)生率無增加，骨骼染色觀察發(fā)現(xiàn)高劑量組小鼠后囟門顯著大于其他3組(P<0.05)。18 d與48 d小鼠部分臟器指數(shù)存在顯著差異，但病理切片觀察發(fā)現(xiàn)僅高劑量組腎臟有病變發(fā)生。試驗(yàn)結(jié)果表明，蘇云金芽孢桿菌BtZ01在濃度為108CFU·mL-1及以下時對小鼠胚胎發(fā)育及胚后生長發(fā)育無不良影響。

蘇云金芽孢桿菌；小鼠；行為致畸學(xué)；胚胎發(fā)育；胚后發(fā)育

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)作為一種生物胃毒性殺蟲劑，因其對多種害蟲具有特異性毒殺作用而倍受人們關(guān)注。與化學(xué)農(nóng)藥等其他類型的殺蟲劑相比，Bt殺蟲劑具有殺蟲特異性強(qiáng)，對人、畜及非目標(biāo)昆蟲無毒副作用，安全性能好，對環(huán)境無污染等特點(diǎn)[1]。但其安全性具有一定的局限性，Bt菌的毒性取決于其血清型或活性成分、濃度等因素，甚至與Bt菌的培養(yǎng)條件也有關(guān)系[2]。據(jù)報道，部分Bt菌株在108CFU·mL-1濃度下對小鼠鼻腔感染的致死率超過50%，甚至達(dá)到100%[3]。而讓人們最擔(dān)心的是許多菌株能夠產(chǎn)生腸毒素，從而引發(fā)人和動物發(fā)病[4-5]。一直以來，人們都在致力于Bt菌的安全性研究，但對于動物直接采食Bt菌制劑后對動物的胚胎及胚后動物的發(fā)育、生長是否有影響，至今仍無報道。因此，本試驗(yàn)將不同濃度蘇云金桿菌菌液直接給予懷孕小鼠，以觀察小鼠胚胎發(fā)育及胚后生長發(fā)育情況，為蘇云金芽孢桿菌的更廣泛應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 菌株

蘇云金芽孢桿菌BtZ01(Bacillus thuringiensis Z01)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

1.1.2 試驗(yàn)動物

健康成熟KM小鼠90只，購自四川成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司。其中雌鼠60只，體重30～35 g，雄鼠30只，體重30～40 g，未交配。

1.1.3 小鼠日糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧為玉米淀粉-豆粕半純合日糧，參照小鼠的營養(yǎng)需要，按照動物日糧配方AOAC配制，基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

取蘇云金芽孢桿菌BtZ01甘油冷藏菌種，經(jīng)LB瓊脂平板活化后轉(zhuǎn)接到LB肉湯中，37 ℃、160 r·min-1振蕩培養(yǎng)36 h。采用稀釋平板計(jì)數(shù)法測定菌液濃度，用滅菌水調(diào)整細(xì)菌濃度為1×106CFU·mL-1、1×108CFU·mL-1、5×109CFU·mL-1的菌懸液。

表1 小鼠基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平Table 1 Composition and nutrition level of the basal diet of mice

1.2.2 受孕檢查及劑量分組

小鼠的飼養(yǎng)與孕鼠的獲得參照文獻(xiàn)方法[6]。取妊娠0 d的孕鼠48只，隨機(jī)分成4組，即對照組(1組)、低(2組)、中(3組)和高(4組)劑量組，每組12只。對照組自由飲用無菌水，低、中、高劑量組分別飲用含Bt菌為106CFU·mL-1、108CFU·mL-1、5×109CFU·mL-1濃度的菌懸液。

1.2.3 孕鼠與胚鼠觀察

試驗(yàn)采用行為致畸學(xué)(常規(guī)致畸試驗(yàn))方法[7]，觀察孕鼠活動情況、食物消耗及排便情況，并分別在妊娠的0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d稱量孕鼠體重并記錄，以0 d的體重增長率為0.00，計(jì)算每3 d的體重增長率。

第n個3d體重增長率=

(1)

孕鼠妊娠18 d稱重，每組隨機(jī)取6只處死，鑒別活胎、死胎、吸收胎等并分離胎盤稱重。胎鼠外觀畸形檢查后用茜素紅染色，制成骨標(biāo)本，測量囟門大小并檢測骨骼發(fā)育狀況[8]。

1.2.4 胚后小鼠的生長發(fā)育觀察

每組剩余6只孕鼠繼續(xù)飼喂直至分娩，仔鼠自由飲用與母鼠含相同濃度的Bt菌懸液，分娩后18 d做斷奶處理，于48 d試驗(yàn)結(jié)束。分別在分娩0 d、18 d和48 d測量小鼠體長并稱重。18 d時每組取9只小鼠測量其臟器指數(shù)并制作空腸切片，測量腸絨毛高度；48 d時同樣方法測量臟器指數(shù)，制作臟器切片。腸絨毛高度使用cellSens Standard圖像分析軟件測量，臟器指數(shù)計(jì)算公式如下：

(2)

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan’s法多重比較差異的顯著性，差異顯著定義為P<0.05，數(shù)據(jù)采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 孕鼠體重增長情況

高劑量組孕鼠在更換飲水2 d內(nèi)飲水量和攝食量減少明顯，之后恢復(fù)正常，其他組不明顯。稱量結(jié)果也顯示，第1個3 d各組均有小鼠出現(xiàn)體重負(fù)增長，這可能是與受孕與飲水更換等應(yīng)激有關(guān)。試驗(yàn)組與對照組之間及試驗(yàn)組各組間孕鼠每3 d的體重增長百分率無顯著差異(P>0.05)。

表2 BT菌劑對孕鼠每3天體重增長百分率的影響(%)Table 2 The effect of BT agents on pregnant mice’ weight gain percentage for every 3 days (%)

注：同行間進(jìn)行多重比較，差異均不顯著(P>0.05)。表5同。

Note: Multiple comparisons in the same row, there is no significant difference (P>0.05). The same in table 5.

2.2 胚鼠生長發(fā)育情況

孕鼠受精卵發(fā)育情況見表3。在孕鼠致畸敏感期給予大劑量的蘇云金芽孢桿菌菌劑后，各試驗(yàn)組與對照組在孕卵著床總數(shù)、活胎數(shù)、死胎和吸收胎率上均無顯著差異(P>0.05)。各試驗(yàn)組小鼠胎盤重，胎鼠體重、身長和尾長均與對照組無異(P>0.05)。

表3 BT菌劑對孕鼠生殖能力的影響Table 3 Effect of BT agents on reproductive performance for pregnant mice

注：同列間進(jìn)行多重比較，肩標(biāo)中小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)；字母相同或未標(biāo)字母者表示差異不顯著(P>0.05)。表4、6、7同。

Note: Multiple comparisons in the same column, values with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05); not marked or marked with the same letter indicated insignificant difference (P>0.05). The same in table 4, 6, 7.

2.3 胎鼠畸形檢查

胎鼠外部檢查如頭顱、面部、脊柱和四肢等發(fā)育均正常。骨骼染色檢查胸骨、肋骨、脊柱等未發(fā)現(xiàn)有骨骼愈合不全、融合、縱裂以及胸骨肋骨缺失等情況。僅高劑量組部分胎鼠胸骨和枕骨著色較淺。囟門測量結(jié)果顯示高劑量組小鼠后囟門寬度與其他3組差異顯著(P<0.05)，各組間前囟門與矢狀縫的大小差異不顯著(P>0.05)。各組胎鼠囟門發(fā)育情況見表4。

2.4 胚后小鼠生長發(fā)育情況

母鼠分娩僅有對照組和高劑量組各產(chǎn)下一枚死胎，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。測量分娩0 d、18 d、48 d的小鼠體重與體長，各組之間并無顯著性差異(P>0.05)。小鼠體重與體長見表5。

2.5 胚后小鼠臟器指數(shù)變化

18日齡和48日齡小鼠臟器指數(shù)見表6。18 d時，高劑量組小鼠心臟指數(shù)明顯高于對照組(P<0.05)；中、高劑量組小鼠腎臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；試驗(yàn)組小鼠胸腺指數(shù)均高于對照組(P<0.05)；各組小鼠的肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。48 d時，中、高劑量組小鼠的腎臟指數(shù)顯著高于對照組(P>0.05)；高劑量組小鼠的肝臟指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)；其他臟器指數(shù)在4組之間無差異(P>0.05)。

2.6 胚后小鼠腸道形態(tài)觀察

由表7可知，18 d時，各試驗(yàn)組與對照組小鼠的空腸絨毛高度、腺窩深度以及絨毛高度/腺窩深度比值并不存在差異(P>0.05)。48 d中、高劑量組小鼠腸絨毛和腸絨毛高度/腺窩深度比值均顯著高于對照組(P<0.05)，各組間腺窩深度無差異(P>0.05)。

2.7 病理變化觀察

顯微鏡下可見各組小鼠肝臟和脾臟均未出現(xiàn)病理變化。肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝小葉無腫脹和壞死，無炎性細(xì)胞浸潤和纖維結(jié)締組織增生(圖1)。脾臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，生發(fā)中心明顯，紅白髓界限清晰(圖2)。僅高劑量組小鼠腎臟有病變發(fā)生，主要表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞間隙模糊，腎小囊腔變窄，其他3組無病變(圖3)。

表4 BT菌劑對胎鼠囟門發(fā)育的影響Table 4 Effect of BT agents on fontanels’ development of fetal mice

表5 胚后小鼠體重與體長Table 5 Weight and length of post-embryonic mice

表6 小鼠器官指數(shù)(%)Table 6 The organ indexes of instar mice (%)

表7 BT菌劑對小鼠小腸形態(tài)的影響Table 7 The effect of BT agent on intestinal morphology of mice

圖1 48日齡小鼠肝臟組織切片(H.E. 200×)Fig. 1 Liver tissue of 48- days mice (H.E. 200×)

3 討論(Discussion)

蘇云金桿菌含有多種毒素成分，但其殺蟲活性主要取決于產(chǎn)品中芽孢數(shù)量和伴孢晶體蛋白(ICPs)的表達(dá)量[9]，即產(chǎn)品的毒效與發(fā)酵液中芽孢含量存在一定的相關(guān)性。本試驗(yàn)使用36 h的Bt培養(yǎng)物制備菌懸液，不僅含有豐富的芽孢與伴孢晶體蛋白，同時還包含有營養(yǎng)期殺蟲蛋白在內(nèi)的其他活性產(chǎn)物，能夠很好的模擬實(shí)際產(chǎn)品情況。

試驗(yàn)使用Bt培養(yǎng)物直接飼喂孕鼠，首先探究了其在生殖發(fā)育敏感時期對胚胎的影響。當(dāng)一些高脂溶性藥物和小分子物質(zhì)通過胎盤直接作用于胚胎時，便會發(fā)生胚胎毒性，表現(xiàn)為胚胎體重下降、發(fā)育遲緩和胚胎吸收等現(xiàn)象[10]。試驗(yàn)中，各組胎盤、體重、體長無差異，吸收、死胎率無上升趨勢，這些數(shù)據(jù)顯示胎兒未出現(xiàn)胚胎毒性。骨骼檢查雖未有明顯的畸形發(fā)生，但高劑量組有骨骼著色較淺，可能是骨化不全或者是發(fā)育緩慢。囟門大小測量顯示高劑量組小鼠與其他組存在差異。由于囟門的大小可作為顱骨骨化和發(fā)育速度的標(biāo)志[11]，因此可認(rèn)為高劑量的Bt可能對胎鼠的發(fā)育有延遲作用。

小鼠胚后發(fā)育的影響主要以臟器指數(shù)、空腸絨毛發(fā)育情況和病理切片為依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，胚后小鼠的體重，各劑量組雖與對照組沒有顯著差異，但各劑量組均比對照組高，表明Bt菌對胚后小鼠具有一定的促進(jìn)生長作用。Bt中含有的部分非殺蟲活性成分，如：蘇云金素(Thuringiensin)、溶血素(Hemolysin)、腸毒素(Enterotoxin)和免疫抑制因子A(InA)等，雖表達(dá)分泌較少，但其本身對人和哺乳動物存在潛在的毒性作用[12]。高劑量小鼠出現(xiàn)了腎臟毒性，可能是因?yàn)锽tZ01能夠分泌產(chǎn)生上述一種或多種活性物質(zhì)，長期大劑量的攝入導(dǎo)致毒性作用的積累。臟器指數(shù)被認(rèn)為是反映毒性成分對臟器影響的重要指標(biāo)[13]，但試驗(yàn)結(jié)果顯示，臟器指數(shù)有顯著差異的，切片觀察不一定有病變。對兩者結(jié)合可見，僅高劑量組小鼠腎臟有病變發(fā)生。其他無病變但臟器指數(shù)增加的器官，可能是充分行使其功能所致。另外，單純使用臟器指數(shù)來評判病變情況并不準(zhǔn)確，實(shí)踐中必須結(jié)合多種方法進(jìn)行綜合評判方可定論。小腸絨毛的發(fā)育情況及腸道內(nèi)環(huán)境不僅決定著機(jī)體消化吸收能力的強(qiáng)弱，更反映出機(jī)體的健康狀況。中、高劑量組小鼠的腸絨毛高度明顯高于對照組，還有可能與絨毛另一個重要功能有關(guān)：通過其強(qiáng)有力、有規(guī)律擺動來排斥有害菌群的定植[14]。

大量的研究表明，Bt對小鼠產(chǎn)生毒性的最低劑量為108CFU·mL-1，對人類產(chǎn)生毒性的最低劑量應(yīng)按照體重比進(jìn)行轉(zhuǎn)換，為小鼠的1 000倍。而調(diào)查研究表明，即使是從事生物農(nóng)藥噴霧的工人，整個噴霧季節(jié)的累計(jì)Bt接觸量還不到109CFU(小鼠轉(zhuǎn)換劑量為106CFU)[2]。試驗(yàn)中，中、低劑量組小鼠未有任何毒性作用體現(xiàn)，相反在部分臟器和腸道發(fā)育上還表現(xiàn)出Bt對其具有一定促進(jìn)作用；高劑量組小鼠一方面也存在著部分臟器功能更加完善的現(xiàn)象，另一方面卻表現(xiàn)出一定程度的毒性作用。以上試驗(yàn)結(jié)果表明BtZ01作為生物殺蟲劑使用時對人與大型哺乳動物具有較高的安全性；但生產(chǎn)實(shí)踐時也應(yīng)同時根據(jù)小型哺乳動物與產(chǎn)品的接觸系數(shù)以及出現(xiàn)毒性的最低劑量，控制產(chǎn)品的最高濃度并制定科學(xué)、合理的用藥方案(用藥途徑、用藥時機(jī)以及用藥間隔期等)，確保其對小型哺乳動物的安全性。

綜上可知，給予懷孕母鼠和胚后小鼠自由飲用含有108CFU·mL-1及以下濃度的蘇云金芽孢桿菌菌懸液，對小鼠胚胎及胚后小鼠生長發(fā)育未產(chǎn)生不良影響；濃度提高為5×109CFU·mL-1時，則可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腎臟毒性并出現(xiàn)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象。

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◆

Impact ofBacillusthuringiensisBtZ01 on Growth and Development in Embryonic and Post-embryonic Periods of Mice

Chen Bo, Gu Mingjuan, Zhu Yao, Liu Yongliang, Pan Kangcheng*

Research Center of Animal Microecology, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China

19 September 2014 accepted 27 October 2014

This study was to investigate the impact of Bacillus thuringiensis BtZ01 on growth and development in embryonic and post-embryonic periods of mice. Forty eight pregnant Kunming mice were randomly assigned into four groups. The control group was fed with sterilized water and the treated groups were fed with sterile saline containing 106CFU·mL-1, 108CFU·mL-1, 5×109CFU·mL-1BtZ01, respectively. In the present study, the body weight and organ weight ratios were measured, and as well as bone malformations and microscopic pathology were examined. Results indicated that there were no significantly differences between the control and the treated groups for mice’s length and weight gain (P>0.05). The malformations ratios of the control and the treated groups were not different (P>0.05). However, the fontanels of high-dose group (5×109CFU·mL-1BtZ01) were wider and their kidneys were changed, compared with the control groups. Generally, our results showed that the Bacillus thuringiensis BtZ01 has no adverse or toxic effects on embryonic and post-embryonic mice in a dose of 108CFU·mL-1.

Bacillus thuringiensis; mice; behavioral teratogenicity; embryogenesis; post-embryonic development

“教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(IRT0848)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和科研興趣培養(yǎng)計(jì)劃(1310626013)

陳波(1991-)，男，碩士，研究方向?yàn)閯游镂⑸鷳B(tài)學(xué)，E-mail: chenbob2009@hotmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: pankangcheng71@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20140919003

2014-09-19 錄用日期：2014-10-27

1673-5897(2015)2-325-07

X171.5

A

潘康成(1971—)，男，博士，教授，主要從事動物微生態(tài)學(xué)研究。

陳波, 谷明娟, 朱遙, 等. 蘇云金芽孢桿菌BtZ01對小鼠胚胎和胚后發(fā)育的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 325-331

Chen B, Gu M J, Zhu Y, et al. Impact of Bacillus thuringiensis BtZ01 on growth and development in embryonic and post-embryonic periods of mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 325-331 (in Chinese)