7種酚類化學(xué)物質(zhì)對活性污泥的呼吸抑制作用

古文，周林軍，劉濟(jì)寧，石利利,*，陳國松

1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，南京 210009

7種酚類化學(xué)物質(zhì)對活性污泥的呼吸抑制作用

古文1,2，周林軍1，劉濟(jì)寧1，石利利1,*，陳國松2

1. 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所，南京 210042 2. 南京工業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，南京 210009

苯酚類化學(xué)物質(zhì)是廢水中常見的有機(jī)污染物，其對活性污泥的毒性數(shù)據(jù)對于污水處理廠穩(wěn)定運(yùn)行和化學(xué)品危害性評估具有重要意義。本研究采用活性污泥呼吸抑制試驗(yàn)(209)測定7種酚類化學(xué)物質(zhì)對活性污泥的呼吸抑制作用。結(jié)果顯示，2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚對活性污泥未產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)；2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和對甲酚等5種化學(xué)物質(zhì)都對活性污泥呼吸有不同程度的抑制效應(yīng)，3 h-EC50值分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1，構(gòu)效關(guān)系分析結(jié)果表明-Cl、-NO2等官能團(tuán)是導(dǎo)致活性污泥呼吸抑制效應(yīng)增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。在化學(xué)品生物降解性測試研究中，要確保有毒化學(xué)物質(zhì)的測試濃度低于EC50值的1/10。

酚類化學(xué)物質(zhì)；活性污泥；呼吸抑制；毒性

化學(xué)品的大量使用在造福人類的同時，也給人與環(huán)境帶來了嚴(yán)重的危害。具有持久性、富集性和生物毒性的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境后，對自然生態(tài)系統(tǒng)包括微生物、無脊椎動物、脊椎動物等不同營養(yǎng)級物種造成不同程度的影響[1]。

有機(jī)化學(xué)品一般先隨廢水通過工業(yè)或生活污水處理廠的活性污泥工藝(activate sludge process, ASP)[2]進(jìn)行生化處理，被活性污泥中的微生物降解和氧化，從而從污水中去除[3-4]。通常ASP能夠降解大多數(shù)易降解化學(xué)物質(zhì)，從而顯著的降低化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中的殘留濃度。但是有些化學(xué)物質(zhì)會對活性污泥產(chǎn)生一定的毒性效應(yīng)，如芳香類化學(xué)物質(zhì)的存在會降低細(xì)菌細(xì)胞對碳源的生物利用，改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，從而引起系統(tǒng)溶解氧的降低[5]，以及污泥膨脹和降低泥水分離的效率，最終導(dǎo)致有機(jī)化合物的去除率下降和污水處理廠操作異常[6]。在化學(xué)品的風(fēng)險評估中，生物降解性數(shù)據(jù)是評估化學(xué)物質(zhì)持久性等危害特性的重要數(shù)據(jù)。生物降解測試之前應(yīng)先開展化學(xué)物質(zhì)對微生物的毒性評估，生物降解試驗(yàn)中受試化學(xué)物質(zhì)的濃度都應(yīng)低于EC50的1/10，以確保其不會對接種物產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而準(zhǔn)確的評估化學(xué)物質(zhì)的生物降解性。因此化學(xué)品對活性污泥的呼吸抑制毒性數(shù)據(jù)對于評估化學(xué)品的危害性具有重要意義。

為了評估化學(xué)品對活性污泥的呼吸抑制毒性效應(yīng)，國內(nèi)外研究人員采用了多種測定方法，如發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)[7]、硝化抑制試驗(yàn)[8]、呼吸抑制試驗(yàn)[9]、微生物生長代謝測定以及酶活抑制[10]等。然而，生物發(fā)光試驗(yàn)、微生物生長代謝試驗(yàn)、酶活測定方法耗時耗材，且操作相對繁瑣，而活性污泥呼吸抑制試驗(yàn)方法快速、可靠，并且成本低廉，能夠很好的評估化學(xué)品對活性污泥的毒性效應(yīng)。

酚類化學(xué)物質(zhì)廣泛用于印染、農(nóng)藥、醫(yī)藥、石油化工[11-12]等行業(yè)，它們大都是芳香烴的羥基衍生物，是工業(yè)廢水中常見的有機(jī)污染物，具有原生質(zhì)毒，對所有生物活性體均能產(chǎn)生毒性，有些甚至屬高毒物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗降解能力和環(huán)境持久性[13]。近年來，氯代酚等多種酚類化學(xué)物質(zhì)已被列入美國環(huán)保局(EPA)和中國環(huán)境保護(hù)部的優(yōu)先污染物名單[14]。本文根據(jù)化學(xué)品測試方法209(活性污泥呼吸抑制試驗(yàn))[15]，選擇7種典型酚類化學(xué)物質(zhì)測定對活性污泥的呼吸抑制毒性，并初步探討了對活性污泥的毒性機(jī)制。該研究為化學(xué)品的風(fēng)險評估，尤其是對接種物的毒性和降解性評估提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和方法學(xué)參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

CR22GⅡ冷凍干燥離心機(jī)(HITACHI HIIMAC，日本)、MS105-DU電子天平(Mettle Toledo，瑞士)、曝氣泵(ACO-002，上海)、溶解氧-pH測定儀(HQ-40d，美國)、恒溫磁力攪拌器(國華，HJ-3)、純水儀(Milli-Q，美國)。

受試物信息：2-苯基苯酚(CAS：90-43-7，AR，百靈威化學(xué))；4-硝基苯酚(CAS：100-02-7，AR，百靈威化學(xué))；2,6-二叔丁基苯酚(CAS：128-39-2，AR，百靈威化學(xué))；對特辛基苯酚(CAS：140-66-9，AR，百靈威化學(xué))；對甲基苯酚(CAS：1319-77-3，AR，百靈威化學(xué))；4-氯苯酚(CAS：106-48-9，AR，百靈威化學(xué))；2,4-二氯苯酚(CAS：120-83-2，AR，百靈威化學(xué))；參比物：3,5-二氯苯酚(CAS：591-35-5，AR，百靈威化學(xué))。

活性污泥采自南京某污水處理廠曝氣池，活性污泥培養(yǎng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法[15]。培養(yǎng)基組成為：蛋白胨16 g·L-1、牛肉浸膏11 g·L-1、尿素3 g·L-1、NaCl 0.7 g·L-1、CaCl2·2H2O 0.4 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.2 g·L-1、K2HPO42.8 g·L-1。預(yù)處理的活性污泥懸浮液濃度為1 500 mg·L-1，在充氧條件下連續(xù)馴化24 h。

1.2 呼吸抑制測試

試驗(yàn)中用1 L燒杯作為培養(yǎng)瓶，每只培養(yǎng)瓶添加一定濃度的酚類受試物，污泥懸浮液250 mL，合成污水16 mL，最后用去離子水定容至500 mL。此外，用2個不含受試物的培養(yǎng)瓶作為空白對照。試驗(yàn)采用3,5-二氯苯酚作為參比物檢驗(yàn)污泥的活性，參比物對照組中3,5-二氯苯酚濃度分別為3 mg·L-1、10 mg·L-1和30 mg·L-1。每只培養(yǎng)瓶用曝氣泵連續(xù)充氧曝氣3 h，3 h曝氣停止后迅速測量各個培養(yǎng)瓶內(nèi)溶解氧的變化情況。

預(yù)試驗(yàn)中各受試物的添加濃度分別為10 mg·L-1、100 mg·L-1和1 000 mg·L-1。如果預(yù)試驗(yàn)結(jié)果EC50小于1 000 mg·L-1，則開展正式試驗(yàn)。正式試驗(yàn)中受試物濃度按照預(yù)試驗(yàn)的EC50值設(shè)置，正式試驗(yàn)中每個試驗(yàn)濃度采用2個平行對照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

(1)呼吸速率計(jì)算

活性污泥耗氧速率R按下列公式計(jì)算：

(1)

式中：R為活性污泥耗氧速率(mg O2·(L·h)-1)；Q1為氧氣吸收的上限值mg·L-1；Q2為氧氣吸收的下限值mg·L-1；Δt為2次測量的時間間隔(s)。

(2)抑制率計(jì)算

(2)

式中：I為抑制率，F(xiàn)A為受試物的呼吸速率，F(xiàn)B為空白對照的平均呼吸速率。

利用Origin8軟件以及Logistic方程推算受試物EC50。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 活性污泥活性檢驗(yàn)

采用3,5-二氯苯酚作為參比物，檢驗(yàn)活性污泥的活性及試驗(yàn)條件的可靠性。圖1(a)為3,5-二氯苯酚的呼吸速率曲線，結(jié)果表明在15 min內(nèi)隨著參比物濃度的增加，呼吸速率曲線變緩，呼吸速率下降。圖1(b)為3,5-二氯苯酚的劑量-效應(yīng)曲線，3,5-二氯苯酚的EC50為16.0 mg·L-1，該值同Polo等

[16]測定的3,5-二氯苯酚EC50=14.2 mg·L-1相吻合。同時該值處于有效性標(biāo)準(zhǔn)2～25 mg·L-1[15]之間，表明活性污泥性能良好，可用于呼吸抑制毒性的測定。

2.2 酚類受試物對活性污泥的呼吸抑制影響

2.2.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)中酚類受試物濃度分別為10、100、1 000 mg·L-1，7種物質(zhì)對活性污泥的呼吸速率的結(jié)果見圖2。當(dāng)濃度在10～1 000 mg·L-1的范圍內(nèi)時，2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚對污泥的呼吸并未產(chǎn)生明顯的抑制( 3 h-EC50>1 000 mg·L-1)。4-硝基苯酚、2-苯基苯酚、對甲酚、4-氯苯酚和2,4-二氯苯酚這5種物質(zhì)隨著濃度的增高，污泥呼吸速率明顯下降，表明該5種物質(zhì)對活性污泥具有不同程度的毒性。2,6-二叔丁基苯酚和對特辛基苯酚是白色片狀且難溶于水的固體，生物利用度很低，毒性效應(yīng)也較低。2,6-二叔丁基苯酚是一種重要的酚類抗氧化劑，侯春生[17]發(fā)現(xiàn)蜂王漿中的2,6-二叔丁基苯酚能夠強(qiáng)烈的清除超氧自由基與對羥自由基，具有較低毒性，且對生物體具有抗衰老等特點(diǎn)，與本文研究結(jié)果一致。

2.2.2 正式試驗(yàn)結(jié)果

對預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示有抑制效應(yīng)的5種物質(zhì)開展正式試驗(yàn)，圖3顯示活性污泥暴露于不同濃度的酚類化學(xué)物質(zhì)時溶解氧隨時間的變化情況。結(jié)果顯示，空白對照的溶解氧隨時間推移很快下降到最低值。由于采集的污泥為好氧活性污泥，微生物在其生存過程中要消耗大量氧氣，因此曝氣停止后，空白對照的溶解氧隨時間推移呈現(xiàn)有規(guī)律的下降。然而在添加酚類化學(xué)物質(zhì)后，溶解氧隨時間下降的速率相比于空白對照變慢，并且隨著濃度升高呼吸速率更加緩慢，表明添加酚類化學(xué)品后，活性污泥內(nèi)源呼吸逐步受到抑制，活性污泥呼吸速率逐漸減小，從而試驗(yàn)體系中溶解氧消耗速率降低。當(dāng)4-硝基苯酚的濃度達(dá)到800 mg·L-1時，溶解氧濃度在200 s之內(nèi)幾乎停止下降，始終維持在9 mg O2·L-1，表明活性污泥的呼吸幾乎完全被抑制。Ho等[18]使用變性梯度凝膠電泳(DGGE)觀察到微生物多樣性隨著甲酚濃度增高而減少，并且通過測定酶活發(fā)現(xiàn)甲酚濃度超過100 mg·L-1以后，酶活性開始下降，從而導(dǎo)致甲酚降解性下降以及細(xì)胞增長速率的下降。

圖1 3,5-二氯苯酚溶解氧-時間變化曲線(a)和呼吸抑制率-濃度變化曲線(b)Fig. 1 (a) Curve of dissolved oxygen against the time for 3,5-di-chlorophenol; (b) Curve of respiration inhibition rate against the concentration of 3, 5-di-chlorophenol

圖2 預(yù)試驗(yàn)中酚類化學(xué)物質(zhì)濃度與活性污泥呼吸速率變化曲線Fig. 2 Curve of activated sludge respiration rate against the concentration of each phenolic chemicals during preliminary test

圖3 正式試驗(yàn)中各酚類化學(xué)物質(zhì)的溶解氧-時間變化曲線Fig. 3 The curves of dissolved oxygen against time for several phenolic chemicals during definitive test

酚類化學(xué)物質(zhì)的呼吸抑制率隨濃度變化曲線見圖4，從圖中可見，5種酚類物質(zhì)對活性污泥的呼吸抑制效應(yīng)隨著濃度的增加而增加。表1為7種酚類受試物分別在預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)中獲得的EC50數(shù)據(jù)，結(jié)合圖4可知各酚類物質(zhì)的毒性從大到小順序依次為2, 4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基苯酚、4-氯酚和對甲酚，EC50分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。

2.2.3 氯原子對毒性效應(yīng)的影響

2,4-二氯酚對活性污泥的抑制效應(yīng)( EC50=49.7 mg·L-1)明顯高于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，可能是因?yàn)?,4-二氯酚容易比4-氯酚吸附于污泥，且更易于進(jìn)入細(xì)胞膜。研究表明，活性污泥中的微生物細(xì)胞主要靠含大量水分的胞外聚合物質(zhì)(EPS)保護(hù)從而不受外界有毒物侵害[9,19]，而EPS內(nèi)親疏水基團(tuán)的比例成為有機(jī)污染物吸附能力的關(guān)鍵[20-21]。對于酚類化學(xué)物質(zhì)來說，通過電離以及未電離的形式擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞膜速率的不同導(dǎo)致它們各自不同的毒性[22]。4-氯酚和2,4-二氯酚都是難溶

于水的化合物，具有一定的脂溶性，氯原子數(shù)量的不同導(dǎo)致其各自疏水性能的大小，最終影響著各自在細(xì)胞膜上的吸附、積累、界面?zhèn)鬏斠约芭c酶蛋白結(jié)合等過程，有機(jī)物脂溶性越強(qiáng)越易穿過細(xì)胞膜被吸附[23]，從而干預(yù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，核酸以及部分酶的正常代謝，對活性污泥微生物產(chǎn)生較高的毒性。Chen等[3]研究發(fā)現(xiàn)2,4-二氯酚在1～20 mg·L-1時活性污泥的氧呼吸速率開始有了輕微減小，同時在添加較高濃度的2,4-二氯酚時，由于促使污泥產(chǎn)生較多的EPS，從而活性污泥的理化性質(zhì)以及絮凝能力都受到影響。

2.2.4 暴露時間對毒性效應(yīng)的影響

4-氯酚以及2, 4-二氯酚具有一定的揮發(fā)性，為了避免試驗(yàn)過程中隨著時間延長而揮發(fā)損失，正式試驗(yàn)中將暴露周期由原來的3 h調(diào)整為0.5 h，同時為了增加受試物同污泥的有效接觸，試驗(yàn)前各個物質(zhì)進(jìn)行了加熱攪拌使其最大程度的溶解。從表1中可以發(fā)現(xiàn)2種物質(zhì)正式試驗(yàn)的EC50同預(yù)試驗(yàn)結(jié)果都存在差異，表明暴露時間以及溫度的改變對物質(zhì)的毒性有著直接的影響。

圖4 酚類化學(xué)物質(zhì)的抑制率隨濃度變化曲線Fig. 4 The curve of respiration inhibition rate against the concentration of phenolic chemicals

表1 5種酚類化學(xué)物質(zhì)的預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)3 h-EC50和95%置信限Table 1 EC50 value and 95% confidence limit for phenolic chemicals during preliminary test and definitive test

2.2.5 呼吸抑制法與發(fā)光細(xì)菌法對EC50的影響

Polo等[12]使用OECD方法得出的4-氯酚在好氧條件下EC50是97 mg·L-1，使用發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)的結(jié)果為1.9 mg·L-1。提出了氯酚類物質(zhì)的毒性受到取代氯原子的位置和數(shù)量的影響這一規(guī)律。據(jù)報道當(dāng)氯占據(jù)鄰位基團(tuán)時，氯酚類物質(zhì)的毒性會減小[24-25]。李娟英等[10]研究了2, 4-二氯酚對海水發(fā)光菌以及脫氫酶活性的抑制，結(jié)果表明2, 4-二氯酚對發(fā)光細(xì)菌EC50為4.95 mg·L-1，對脫氫酶活性的EC50為37 mg·L-1。分析可知，發(fā)光細(xì)菌試驗(yàn)EC50與本文試驗(yàn)結(jié)果相比偏小，可能是因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)對單一菌群的抑制效應(yīng)較混合菌群( 活性污泥)的抑制效應(yīng)更為明顯。因此為了更準(zhǔn)確、科學(xué)地判定污水處理廠中有機(jī)污染物的毒性，應(yīng)當(dāng)將發(fā)光細(xì)菌這一類生物同活性污泥聯(lián)立起來開展化學(xué)品毒性測試。

2.2.6 官能團(tuán)對毒性效應(yīng)的影響

本研究中7種苯酚類化學(xué)物質(zhì)所含的官能團(tuán)分別有-NO2、-Cl、-CH3、苯基、對特辛基、叔丁基和羥基。從研究結(jié)果可以看出，對特辛基、叔丁基和羥基幾乎不會對活性污泥存在抑制效應(yīng)。4-硝基苯酚毒性效應(yīng)( EC50=102 mg·L-1)稍大于4-氯酚( EC50=150 mg·L-1)，2種物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)差異僅在于-NO2和-Cl的差異，說明-NO2對微生物的毒性要高于-Cl。

微生物體內(nèi)含有大量的酶，這些酶通常通過親電效應(yīng)來與化學(xué)品發(fā)生結(jié)合或反應(yīng)。當(dāng)化學(xué)品分子上連接了-Cl、-Br、-NO2等取代基后，由于這些基團(tuán)較強(qiáng)的吸電子效應(yīng)，將會顯著降低酶的性狀和功能。常見的官能團(tuán)中，按照吸電子能力強(qiáng)弱排序?yàn)椋?SO3>-NO2>-Br>-Cl>-H>-NH2>-OCH3>-CH3>-COOH>-OH。因此，4-硝基苯酚、氯酚類化學(xué)品因含-NO2以及-Cl官能團(tuán)，使得它們對微生物的毒性顯著增強(qiáng)，且毒性隨著取代基氯原子增加而變大。由于苯環(huán)上氯原子增多，導(dǎo)致正電性增強(qiáng)，因此氯代芳烴類化合物毒性一般較大[26]。此外，這些毒性基團(tuán)的位置也對毒性效應(yīng)有明顯的差別，毛明現(xiàn)和余訓(xùn)民[27]認(rèn)為氯離羥基越遠(yuǎn)或者多個氯在羥基鄰位的同一側(cè)，則毒性越大。由于引入氯原子后化學(xué)物質(zhì)的毒性明顯加大，故氯原子是影響芳烴化合物毒性的主要基團(tuán)。

綜上，本研究采用209方法，評估7種酚類化學(xué)物質(zhì)對活性污泥微生物的呼吸抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示5種酚類物質(zhì)對微生物呼吸產(chǎn)生明顯的抑制。其毒性大小依次為2,4-二氯酚、2-苯基苯酚、4-硝基酚、4-氯酚和對甲酚，相應(yīng)的EC50值分別為49.7、77.6、102、150.1和462 mg·L-1。研究表明化學(xué)物質(zhì)對微生物的毒性會受到其結(jié)構(gòu)、溶解度、官能團(tuán)的親疏水性等因素影響。此外，本文中獲得的微生物毒性數(shù)據(jù)以及相關(guān)結(jié)論可以為化學(xué)品風(fēng)險評估，特別是酚類化學(xué)品的生物降解性研究以及微生物毒性評價提供有效的建議和參考。

致謝：感謝環(huán)保部南京環(huán)境科學(xué)研究所石利利和劉濟(jì)寧老師在文章修改中給予的幫助。

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Respiratory Inhibition Effect of Seven Phenolic Chemicals on Activated Sludge

Gu Wen1,2, Zhou Linjun1, Liu Jining1, Shi Lili1,*, Chen Guosong2

1. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China 2. College of Science, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China

17 November 2014 accepted 7 January 2015

Phenolic chemicals are ubiquitous organic contaminants in wastewater. The toxicity data of those compounds on activated sludge is of vital importance to steady operating of sewage treatment plant and performing of chemicals hazard assessment. In this study, respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge was tested by employing the activated sludge respiration inhibition test (TG 209). The experimental results indicated that there is no significant respiratory inhibition effect on activated sludge for 2,6-di-tert-butylphenol and 4-(1,1,3, 3-tetramethy(butyl)-phenol. However, significant respiratory inhibition effect on activated sludge was observed for other five tested phenolic chemicals i.e. 2,4-dichlorophenol, 2-phenyl-phenol, 4-nitrophenol, 4-chlorophenol and p-cresol. And their 3 h-EC50values were 49.7, 77.6, 102, 150.1 and 462 mg·L-1, respectively. The structure-activity relationship analysis results indicated that the functional groups such as -Cl, -NO2are key factors for strong inhibiting of activated sludge respiration. In addition, the results present here also imply that the tested concentration of those toxic compounds should be lower than 1/10 EC50in their biodegradability test.

phenolic chemicals; activated sludge; respiratory inhibition; toxicity

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(No.2013AA060A308)；環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(No. 2013467028)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(化學(xué)品污水處理廠暴露預(yù)測模型構(gòu)建)

古文(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)品生態(tài)毒理評價，E-mail: guwen_1224@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: sll@nies.org

10.7524/AJE.1673-5897.20141117002

2014-11-17 錄用日期：2015-01-07

1673-5897(2015)2-276-07

X171.5

A

石利利(1966-)，女，碩士，研究員，主要從事化學(xué)品風(fēng)險評估研究工作。

古文, 周林軍, 劉濟(jì)寧, 等. 7種酚類化學(xué)物質(zhì)對活性污泥的呼吸抑制作用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 276-282

Gu W, Zhou L J, Liu J N, et al. Respiratory inhibition effect of seven phenolic chemicals on activated sludge [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 276-282(in Chinese)