日糧中銅脅迫對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

王文龍，崔欣，安立龍,*，效梅，高涵，李成成，邢星，李延偉，許英梅

1. 廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)系，湛江 524088 2. 廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088 3. 中國(guó)藥科大學(xué) 藥物制劑系，南京 211198 4. 中華人民共和國(guó)欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，欽州 535008

日糧中銅脅迫對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

王文龍1，崔欣1，安立龍1,*，效梅2,#，高涵3，李成成1，邢星4，李延偉1，許英梅1

1. 廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)系，湛江 524088 2. 廣東海洋大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088 3. 中國(guó)藥科大學(xué) 藥物制劑系，南京 211198 4. 中華人民共和國(guó)欽州保稅港區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局，欽州 535008

吉富羅非魚(yú)是我國(guó)南方沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，但近年來(lái)，隨著我國(guó)城鎮(zhèn)化和工業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)，羅非魚(yú)養(yǎng)殖面臨著前所未有的銅富集的挑戰(zhàn)。為探明日糧中銅脅迫對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化系統(tǒng)和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，將1 080條羅非魚(yú)幼魚(yú)暴露于6個(gè)濃度梯度(0、3、30、300、1 000、3 000 mg·kg-1)的高銅日糧中，通過(guò)60 d的暴露試驗(yàn)，實(shí)時(shí)測(cè)定羅非魚(yú)血清與肝臟抗氧化能力，監(jiān)測(cè)肝臟病理變化。結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，羅非魚(yú)幼魚(yú)血清和肝臟中MDA的含量隨日糧中銅含量的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，而SOD、GSH-PX和CuZn-SOD的活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)；各組間肝臟表現(xiàn)出不同程度的病變，主要是濁腫變性和脂肪變性，且第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組肝臟病變嚴(yán)重。綜上，日糧中銅脅迫對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)的抗氧化機(jī)能有較明顯的抑制作用，長(zhǎng)時(shí)間的暴露能?chē)?yán)重?fù)p傷其肝臟的組織結(jié)構(gòu)，因此，建議吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)日糧中銅的實(shí)際含量應(yīng)控制在42.36 mg·kg-1以下。

日糧中銅脅迫；吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)；肝臟病變；抗氧化；脂質(zhì)過(guò)氧化；濁腫變性

現(xiàn)代工業(yè)社會(huì)、社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類各種生產(chǎn)活動(dòng)都會(huì)引起重金屬的輸入，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的危害[1-3]，特別是近幾十年來(lái)隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的不斷升級(jí)，日益加劇的重金屬污染及其引發(fā)的生態(tài)和食品安全問(wèn)題成為我國(guó)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[1,4]。銅(copper, Cu)是主要的重金屬之一，也是有機(jī)生命正常生理生化反應(yīng)必須的微量元素之一[5]，但過(guò)量的Cu則會(huì)導(dǎo)致毒性效應(yīng)，對(duì)生物體機(jī)體造成損傷[2,6]，Cu在水生生物體內(nèi)的富集已經(jīng)成為無(wú)法規(guī)避的安全隱患。

早在20世紀(jì)90年代，西方學(xué)者就已經(jīng)預(yù)見(jiàn)到了水源性和食源性Cu暴露對(duì)水生生物的毒害作用[6-7]，引發(fā)了人們的廣泛關(guān)注。而我國(guó)針對(duì)Cu的生態(tài)毒性研究起步較晚，隨著90年代中后期我國(guó)地域環(huán)境中Cu的輸入量逐漸攀高，Cu等重金屬引發(fā)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全問(wèn)題才慢慢進(jìn)入我國(guó)學(xué)者的視野，過(guò)量的Cu對(duì)水生動(dòng)物肝臟造成巨大傷害，進(jìn)而影響動(dòng)物機(jī)體的抗氧化體系的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，引發(fā)動(dòng)物機(jī)體代謝、免疫等諸多方面功能紊亂[2,4,6]。目前關(guān)于日糧中高Cu脅迫對(duì)畜禽的毒性作用的報(bào)道比較多，但日糧中Cu暴露對(duì)魚(yú)類的毒性研究較少，未見(jiàn)探討日糧中Cu暴露影響羅非魚(yú)抗氧化功能、脂質(zhì)過(guò)氧化和肝臟組織結(jié)構(gòu)的報(bào)道，少數(shù)的相關(guān)研究?jī)H限于對(duì)Cu最適添加量的探索，汪華[8]的研究表明，吉富羅非魚(yú)的日糧Cu需要量為8 mg·kg-1左右，但為保證魚(yú)對(duì)Cu的需要量，魚(yú)日糧中Cu的實(shí)際含量往往大于其實(shí)際需要量，且在不同飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)條件下魚(yú)的需要量和耐受度也不盡相同[9-11]。

本課題組立足于現(xiàn)今重金屬污染愈發(fā)嚴(yán)重，兩廣、福建等地區(qū)水生生物Cu等重金屬富集加劇的大背景下開(kāi)展了一系列關(guān)于羅非魚(yú)Cu耐受以及Cu暴露條件下羅非魚(yú)機(jī)體抗氧化響應(yīng)機(jī)制的工作，前期研究表明，Cu在各組織中積累量的順序依次為：肝臟>脾臟>腸道>鰓>肌肉，與對(duì)照組相比，肝臟、脾臟、腸道中Cu的含量隨著時(shí)間和日糧中Cu濃度的升高而逐漸升高[4]，肝臟是Cu最大的儲(chǔ)存器官，也是魚(yú)體內(nèi)最重要的解毒器官，其病理變化可以直觀地反映出Cu痕量長(zhǎng)時(shí)間蓄積或大量短時(shí)攝入對(duì)魚(yú)體造成損傷，與此同時(shí)，血清生化指標(biāo)也能敏感地反映動(dòng)物機(jī)體的生理狀態(tài)，基于此，本文以飼喂Cu暴露日糧的吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)為模型，研究日糧中Cu暴露對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，探究日糧Cu暴露對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)及功能臟器的損傷機(jī)制，為羅非魚(yú)養(yǎng)殖中日糧Cu的需要量和使用限量研究提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與材料

試驗(yàn)魚(yú)由廣東省吳川國(guó)聯(lián)羅非魚(yú)良種場(chǎng)提供，試驗(yàn)前用藥浴消毒(投入0.02%的高錳酸鉀溶液浸泡5 min，將有不良反應(yīng)的病魚(yú)去除)，用對(duì)照組日糧馴養(yǎng)15 d，使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境及試驗(yàn)日糧，選擇健康無(wú)病、活躍靈敏的個(gè)體作為試驗(yàn)用魚(yú)；試驗(yàn)中Cu以CuSO4·5H2O(分析純，上海易蒙斯化工科技有限公司)形式添加。

1.2 試驗(yàn)日糧

以魚(yú)粉、豆粕、玉米粉、面粉、磷酸二氫鈣、豆油、膽堿、食鹽、預(yù)混料配制基礎(chǔ)日糧，經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩后混勻，微量原料采用逐級(jí)擴(kuò)大法混合，混合均勻后-20 ℃密封保存，備用，試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表1。試驗(yàn)中設(shè)計(jì)Cu的添加梯度為：0 mg·kg-1、3 mg·kg-1、30 mg·kg-1、300 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、3 000 mg·kg-16個(gè)水平，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國(guó)安捷倫科技有限公司)測(cè)得各組日糧中Cu的實(shí)際含量如表2所示。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Ingredients and nutrient level of basal diet (fed-basis)

注：*每千克預(yù)混料含VA 350 000 IU、VD3100 000 IU、VE 4 000 mg、VK3250 mg、VB1400 mg、VB21 500 mg、VB6600 mg、VB122.5 mg、D-泛酸鈣2 000 mg、煙酰胺2 500 mg、葉酸250 mg、D-生物素5 mg、肌醇7 000 mg、VC 6 300 mg、鋅2 250 mg、錳1 200 mg、鐵6 500 mg、鈷120 mg、碘120 mg、硒25 mg。

Note:*Each kilogram of premix provided: VA 350 000 IU, VD3100 000 IU, VE 4 000 mg, VK3250 mg, VB1400 mg, VB21 500 mg, VB6600 mg, VB122.5 mg, calcium D-pantothenate 2 000 mg, nicotinamide 2 500 mg, folic acid 250 mg, biotin 5 mg, Inositol 7 000 mg, VC 6 300 mg, Zn 2 250 mg, Mn 1 200 mg, Fe 6 500 mg, Co 120 mg, I 120 mg, Se 25 mg.

1.3 試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)管理

選取健康無(wú)病的羅非魚(yú)1 080尾(平均體重為(9.20±0.18) g)，將其分為6組(見(jiàn)表2)，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)60尾，飼養(yǎng)在規(guī)格為500 L的玻璃鋼魚(yú)缸中?？諝鈮嚎s機(jī)增氧，每3天監(jiān)測(cè)一次水質(zhì)：水溫為(31.50±1.50) ℃，溶解氧不小于5 mg·L-1，氨氮含量不超過(guò)0.02 mg·L-1，水體pH為7.8～8.3；每3天換水1/2缸，每天上午9點(diǎn)和下午6點(diǎn)投放2次相應(yīng)組別的日糧，日投料量為魚(yú)體重的3%(每10天測(cè)一次魚(yú)的平均體重，及時(shí)調(diào)整日投料量)，30 min后將剩余餌料吸出，烘干稱重，每天觀察記錄羅非魚(yú)攝食和死亡情況。

表2 試驗(yàn)分組Table 2 Design of experiment

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)第20天、40天、60天采樣，采樣前饑餓24 h，每個(gè)重復(fù)取12條魚(yú)，其中4尾進(jìn)行尾靜脈采血，室溫靜置待其凝固后3 000 r·min-1離心10 min，取制得的血清于-20 ℃保存，待測(cè)；余下的8尾魚(yú)則采用搗毀腦髓法處死，其中6尾取肝臟用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗并濾干，切1.0 g左右肝臟組織塊制成10%組織勻漿，冷凍離心機(jī)(3K30，德國(guó)SIGMA公司)2 500 r·min-1離心10 min，取上清液于-20 ℃保存，待測(cè)。脂質(zhì)過(guò)氧化與抗氧化指標(biāo)的測(cè)定均嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所相應(yīng)試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行。

取其余2尾的新鮮肝臟、脾臟用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗并濾干，切成大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小組織塊放于配好的波音氏(Bouin’s)固定液中固定(波音氏液的體積約為組織塊的15～20倍)，固定24 h；再經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(5 μm)、展片、烘干、水洗、染色，最后用中性樹(shù)膠封片，貼上標(biāo)簽并編號(hào)，備用，Nikon-E200顯微鏡下觀察并拍照(Olympus DP70顯微成像系統(tǒng)，奧林巴斯中國(guó)有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s法多重比較差異的顯著性，差異顯著定義為P<0.05，數(shù)據(jù)表示為“Mean±SD”。

2 結(jié)果(Results)

2.1 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

2.1.1 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)MDA含量的影響

由表3可見(jiàn)血清中MDA的含量略低于肝臟中MDA的含量。在第20、40、60天時(shí)，對(duì)照組～Ⅱ組血清中MDA的含量無(wú)顯著差異，Ⅲ～Ⅴ組血清中MDA的含量隨著Cu的升高而逐漸升高，第60天時(shí)第Ⅴ組血清MDA的含量達(dá)到最高(7.08±0.04) nmol·mL-1。

隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組～Ⅲ組血清中MDA的含量無(wú)顯著差異(P>0.05)。第Ⅳ組血清中MDA的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，而第Ⅴ組在第40天時(shí)比在第20天時(shí)顯著升高(P<0.05)，到60 d時(shí)無(wú)顯著變化(P>0.05)。說(shuō)明日糧中高劑量的Cu可引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使血清中MDA含量升高。

肝臟中MDA含量的變化與血清中MDA的變化規(guī)律相似。肝臟中MDA含量在第20天時(shí)對(duì)照組～Ⅲ組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；第Ⅳ組和第Ⅴ組顯著高于其他組。第40天時(shí)，第Ⅰ組中MDA的含量最少，為(5.35±0.02) nmol·mg-1prot，但之后隨著日糧中Cu濃度的升高，肝臟中MDA的含量也隨著升高；而與對(duì)照組相比，第Ⅳ、Ⅴ組肝臟中MDA的含量顯著升高(P<0.05)。第60天時(shí)，肝臟中MDA的含量隨日糧中Cu濃度的升高而升高，第Ⅴ組肝臟中MDA的含量此時(shí)達(dá)到最高，為(8.69±0.05) nmol·mg-1prot。對(duì)照組～第Ⅳ組肝臟中MDA的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化(P>0.05)，而第Ⅴ組肝臟中MDA的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加(P<0.05)，其原因可能是日糧中高Cu引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使肝臟中MDA含量升高。

2.1.2 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)SOD活性的影響

如表4所示，血清中SOD的活性與肝臟差異不顯著。在20 d時(shí)，對(duì)照組～第Ⅱ組血清中SOD的活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，之后隨著Cu的升高SOD的活性也逐漸增強(qiáng)。40 d時(shí)，第Ⅲ組SOD的活性最高，第Ⅴ組次之，最低為第Ⅰ組。60 d時(shí)，隨著日糧中Cu濃度的升高，SOD的活性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，最高是第Ⅱ組，達(dá)到了(115.71±7.25) U·mL-1。對(duì)照組和第Ⅰ組血清中SOD的活性隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，第Ⅱ組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，第Ⅲ組呈先升高后降低的趨勢(shì)，第Ⅳ、Ⅴ組均呈下降的趨勢(shì)，且SOD活性在第60天時(shí)顯著低于第20天時(shí)的活性(P<0.05)。

肝臟中SOD的活性在20 d時(shí)，隨著日糧中Cu濃度的升高也逐漸升高。40 d時(shí)，第Ⅲ組SOD的活性最高，達(dá)到(126.15±19.27) U·mg-1prot。第60天時(shí)，第Ⅰ組SOD的活性最高，為(120.26±14.03) U·mg-1prot，在這2個(gè)時(shí)期，SOD的活性均隨Cu濃度的升高呈現(xiàn)拋物線型變化。

表3 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼魚(yú)的MDA含量Table 3 Concentration of MDA in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

注：同行或同列肩標(biāo)中大寫(xiě)或小寫(xiě)字母完全不同，表示顯著差異(P<0.05)，未標(biāo)字母或字母有相同者表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Note: In the same row or column, values with totally different uppercase or lowercase superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter or no letter mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表4 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼魚(yú)的SOD活性Table 4 Activity of SOD in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

表5 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼魚(yú)的CuZn-SOD活性Table 5 Activity of CuZn-SOD in juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress

隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組肝臟中SOD的活性無(wú)顯著變化(P>0.05)，第Ⅰ組呈上升趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異，第Ⅱ、Ⅲ組為先升高再降低的趨勢(shì)，而第Ⅳ、Ⅴ組呈下降趨勢(shì)，且差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明日糧中高劑量的Cu可能會(huì)抑制血清和肝臟中SOD的活性。

2.1.3 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)CuZn-SOD活性的影響

由表5可知，在第20天時(shí)，各組間血清中CuZn-SOD的活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，第Ⅳ組最低，為(81.05±11.02) U·mL-1，最高的第Ⅲ組為(88.92±7.43) U·mL-1；第40天時(shí)，對(duì)照組和Ⅱ、Ⅲ組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，Ⅰ組和Ⅳ、Ⅴ組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；第60天時(shí)，隨日糧中Cu濃度的升高總體呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，且與對(duì)照組相比，Ⅳ、Ⅴ組顯著降低(P<0.05)。

隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，第Ⅴ組血清中CuZn-SOD的活性顯著降低(P<0.05)，在第20天時(shí)為(84.51±6.53) U·mL-1，第60天時(shí)則降至(76.43±12.72) U·mL-1，其他各組隨日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化(P>0.05)。

肝臟中CuZn-SOD的活性略低于血清。在第20天時(shí)，各組間無(wú)顯著差異；第40天和60天時(shí)，肝臟CuZn-SOD的活性都隨著日糧中Cu濃度的升高而呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，第Ⅱ組在第60天時(shí)最高，為(71.68±8.32) U·mg-1prot，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和Ⅰ、Ⅱ組肝臟中CuZn-SOD的活性無(wú)顯著變化(P>0.05)；第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，第Ⅴ組在60 d時(shí)最低，為(57.92±6.25) U·mg-1prot；表明日糧中過(guò)高濃度的Cu可能會(huì)抑制羅非魚(yú)血清和肝臟中CuZn-SOD的活性。

2.1.4 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)GSH水平和GSH-PX活性的影響

由表6可知，肝臟中GSH的含量在20 d時(shí)隨日糧中Cu濃度的升高逐漸升高，最高的第Ⅴ組達(dá)到了(7.23±0.15) mg·g-1prot，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在40 d時(shí)，各組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；在60 d時(shí)，隨日糧中Cu含量的升高GSH含量逐漸下降。

隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組～第Ⅲ組無(wú)顯著變化，第Ⅳ組GSH含量緩慢下降，但差異不顯著，第Ⅴ組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降(P<0.05)，第60天時(shí)降至最低的(5.20±0.24) mg·g-1prot，這也表明日糧中過(guò)高劑量的Cu可能會(huì)降低肝臟中GSH的含量。

表6 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼魚(yú)肝臟中的 GSH水平(U·mg-1 prot)Table 6 Concentration of GSH in liver of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress (U·mg-1 prot)

如表7所示，在20 d時(shí)，第Ⅳ組和第Ⅴ組GSH-PX的活性分別為(28.64±2.04) U·mg-1prot和(27.75±1.38) U·mg-1prot，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。到第60天時(shí)，隨日糧中Cu含量的升高，各組間呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，第Ⅳ、Ⅴ組GSH-PX的活性顯著降低(P<0.05)。

對(duì)照組和Ⅰ、Ⅱ組中GSH-PX的活性隨著日糧Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，第Ⅱ組在40 d時(shí)含量最低；第Ⅲ組GSH-PX的活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而第Ⅳ、Ⅴ組隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，表明日糧中過(guò)高劑量的Cu也可能會(huì)抑制GSH-PX的活性。

2.2 日糧Cu脅迫對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

2.2.1 肝臟病理解剖的觀察

第20天時(shí)，解剖發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與第Ⅰ～Ⅳ組肝臟顏色正常，表面濕潤(rùn)光滑，質(zhì)地柔軟，富有彈性；第Ⅴ組肝臟顏色略發(fā)黃，質(zhì)地柔軟，彈性略差。第40天時(shí)，對(duì)照組與第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝臟依舊正常，而第Ⅳ組肝臟顏色發(fā)黃，彈性變差；第Ⅴ組肝臟顏色呈淡黃色，質(zhì)地脆軟，部分出現(xiàn)顆粒變性。第60天時(shí)，對(duì)照組與第Ⅰ、Ⅱ組肝臟表現(xiàn)正常，第Ⅲ組肝臟顏色略發(fā)黃。第Ⅳ組肝臟顏色為土黃色，質(zhì)地脆軟，出現(xiàn)顆粒變性。第Ⅴ組肝臟顏色呈土黃色，質(zhì)地脆軟易碎，有明顯的顆粒變性，部分可見(jiàn)出血斑點(diǎn)。

2.2.2 肝臟組織切片的觀察

第20天時(shí)，對(duì)照組和第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈圓形或多角形，細(xì)胞膜完整清晰，細(xì)胞核圓形，染色比較深，細(xì)胞質(zhì)染色較淺(圖1-A1)，肝小葉周邊細(xì)胞呈放射狀排列整齊，肝索結(jié)構(gòu)明顯(圖1-A2)；第Ⅳ組肝臟細(xì)胞中有較小的分散的空泡，細(xì)胞界限不清晰(圖1-B1)；第Ⅴ組肝細(xì)胞中圓形空泡較多，肝細(xì)胞擁擠腫大，核固縮現(xiàn)象明顯，細(xì)胞界限模糊，出現(xiàn)輕度的脂肪變性(圖1-B2)。

表7 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼魚(yú)肝臟中的GSH-PX活性(mg·g-1 prot)Table 7 Activity of GSH-PX in liver of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stress (mg·g-1 prot)

圖1 日糧Cu脅迫條件下羅非魚(yú)幼 魚(yú)肝臟組織病理變化圖注：H.E, ×400；其中，A1、A2為第20天時(shí)肝臟正常結(jié)構(gòu)圖， B1、B2分別為第20天時(shí)Ⅳ組和Ⅴ組的肝臟結(jié)構(gòu)圖， C1、C2、C3分別為第40天時(shí)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的肝臟結(jié)構(gòu)圖， D1、D2、D3分別為第60天時(shí)Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組的肝臟結(jié)構(gòu)圖。Fig. 1 The pathological changes of livers of juvenile GIFT tilapia under dietary Cu stressNote: H.E, ×400; A1 & A2, the normal structure of livers in 20th day; B1, B2, the histological structure of livers in group Ⅳ and Ⅴ in 20th day; C1, C2, C3, the histological structure of livers in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ in 40th day; D1, D2, D3, the histological structure of livers in group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ in 60th day.

第40天時(shí)，對(duì)照組和第Ⅰ、Ⅱ組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；第Ⅲ組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)分散的空泡，細(xì)胞界限模糊，有輕微的核固縮現(xiàn)象(圖1-C1)；第Ⅳ組肝臟出現(xiàn)輕度的脂肪變性，細(xì)胞空泡變大，肝索紊亂，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)細(xì)顆粒物質(zhì)(圖1-C2)；第Ⅴ組肝臟脂肪變性加重，空泡明顯變大，出現(xiàn)局灶性壞死(圖1-C3)。

第60天時(shí)，對(duì)照組和第Ⅰ組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；第Ⅱ組肝臟細(xì)胞出現(xiàn)分散的空泡，細(xì)胞界限開(kāi)始模糊；第Ⅲ組肝臟細(xì)胞中分散空泡變大，細(xì)胞界限更加模糊，核固縮現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)輕度脂肪變性(圖1-D1)；第Ⅳ組肝臟出現(xiàn)大面積的脂肪變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，呈紊亂的一片紅色(圖1-D2)；第Ⅴ組肝臟遭到嚴(yán)重破壞，局灶性壞死現(xiàn)象加劇，壞死處肝細(xì)胞崩解(圖1-D3)。

3 討論(Discussion)

脂質(zhì)過(guò)氧化(lipid peroxidation, LPO)是反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一[12]。劉向陽(yáng)等[13]在日糧中分別添加Cu 0.54 mg·kg-1(缺Cu)和6.05 mg·kg-1(正常Cu)，發(fā)現(xiàn)缺Cu組肝臟中MDA比正常組提高了18%，血漿中MDA也相應(yīng)升高9%，且肝臟中MDA的含量顯著高于血漿中的含量。在本實(shí)驗(yàn)中，肝臟中MDA的含量略高于血清中MDA的含量，對(duì)照組與前3組血清中MDA的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，說(shuō)明日糧中添加低于300 mg·kg-1Cu時(shí)，沒(méi)有造成明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化；而當(dāng)日糧中Cu含量升高為1 057.29 mg·kg-1時(shí)，血清中MDA的含量漸漸升高；當(dāng)添加量達(dá)到3 000 mg·kg-1后，血清中MDA的含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)明顯升高，表明在本試驗(yàn)條件下，日糧中Cu含量為1 057.29 mg·kg-1時(shí)，可引起羅非魚(yú)血清中的脂質(zhì)過(guò)氧化，同樣在肝臟中也可得到類似的結(jié)論。

生物體內(nèi)參與清除過(guò)氧化因子的物質(zhì)主要包括：SOD、CuZn-SOD、GSH和GSH-PX等。在本研究中低濃度組血清中SOD的活性無(wú)顯著差異，而高濃度組與對(duì)照組相比在前期顯著升高，之后又逐漸降低。肝臟中SOD的活性在日糧中Cu含量為1 057.29 mg·kg-1和3 086.76 mg·kg-1時(shí)也表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且隨著日糧中Cu濃度的升高，肝臟中SOD的活性呈下降趨勢(shì)。Knox等[14]研究表明，肝臟中SOD的活性隨著日糧中Cu含量的升高而降低，這與本研究的結(jié)果一致。魯雙慶等[15]在研究Cu對(duì)黃鱔肝臟保護(hù)酶SOD、CAT、GSH-PX活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移，SOD活性表現(xiàn)出先抑制，之后升高又降低的變化趨勢(shì)，本試驗(yàn)前期沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有抑制現(xiàn)象，這可能與Cu的濃度或脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短有關(guān)。肝臟是動(dòng)物體內(nèi)重要的解毒器官，有較強(qiáng)的主動(dòng)調(diào)節(jié)能力，當(dāng)Cu濃度升高時(shí)，羅非魚(yú)肝臟會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性的誘導(dǎo)反應(yīng)，此時(shí)SOD活性增強(qiáng)，清除自由基使機(jī)體免受傷害，但當(dāng)Cu濃度繼續(xù)升高，或時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，超過(guò)肝臟的耐受極限，肝臟就會(huì)表現(xiàn)出中毒反應(yīng)，最后導(dǎo)致SOD活性下降[16]。CuZn-SOD是所有生物體的一種重要的自由基清除劑，保護(hù)機(jī)體免受超氧陰離子的損害[17]。喬永剛[18]分別以硫酸銅和蛋氨酸銅為Cu源，在軍曹魚(yú)基礎(chǔ)日糧中添加0、4、8、16、32、64 mg·kg-1Cu，發(fā)現(xiàn)對(duì)軍曹魚(yú)肝臟中CuZn-SOD的活性無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)中，對(duì)照組與前3組血清中CuZn-SOD的活性沒(méi)有顯著差異，這與喬永剛[18]的研究相一致；但當(dāng)Cu含量超過(guò)1 000 mg·kg-1時(shí)，隨著日糧中Cu脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，CuZn-SOD的活性下降，而且隨著日糧中Cu濃度的升高CuZn-SOD的活性也隨之下降。肝臟中CuZn-SOD的活性也隨著日糧中Cu的增加而下降，且日糧中Cu的添加量超過(guò)300 mg·kg-1時(shí)，隨著時(shí)間的推移，CuZn-SOD的活性就開(kāi)始下降，這也表明肝臟中CuZn-SOD的活性比血清中CuZn-SOD的活性更敏感，而且高Cu抑制了CuZn-SOD的活性。這可能是由于隨著Cu含量的升高，自由基反應(yīng)的速度加快，沒(méi)有被及時(shí)清除的氧自由基就會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加速細(xì)胞衰老，損害細(xì)胞，因此，CuZn-SOD的活性降低可能與細(xì)胞解毒能力的過(guò)飽和有關(guān)。還原型谷胱甘肽(GSH)在分解過(guò)氧化物時(shí)起重要作用，也是生物體內(nèi)含量豐富的抗氧化劑。劉慧等[19]在研究Cu對(duì)鯽魚(yú)肝臟谷胱甘肽的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的Cu誘導(dǎo)下，GSH含量升高，且認(rèn)為肝臟GSH含量的升高是機(jī)體對(duì)Cu濃度升高的適應(yīng)性反應(yīng)。而在本試驗(yàn)前期，隨著日糧中Cu含量的升高肝臟中GSH的含量也隨之升高，這和劉慧等的研究結(jié)果一致。但在中后期第Ⅳ組和第Ⅴ組肝臟中GSH的含量開(kāi)始下降，尤其是第Ⅴ組與對(duì)照組相比顯著下降，而其他組沒(méi)有顯著變化，表明低濃度的Cu并沒(méi)有對(duì)GSH產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。而高濃度組GSH的含量隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，可能是羅非魚(yú)在高濃度Cu的脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧直接與GSH結(jié)合，消耗了GSH；或是高濃度的Cu使得以GSH為底物的酶GSH-PX活性受到抑制，導(dǎo)致的GSH含量下降[20]。GSH-PX是生物體內(nèi)廣泛存在的一種酶，它能催化H2O2分解，從而保護(hù)細(xì)胞免受損害[21]。本實(shí)驗(yàn)中，在第20天時(shí)，隨著日糧中Cu含量的升高，肝臟中GSH-PX的活性也隨之升高，這與Shao等[22]的研究結(jié)果一致。而劉慧等[23]報(bào)道也表明較高濃度的Cu對(duì)彭澤鯽魚(yú)肝臟中GSH-PX的活性均有不同程度的抑制作用；王凡等[24]也發(fā)現(xiàn)，隨著Cu濃度的升高，櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)中GSH-PX的活性表現(xiàn)出先抑制后誘導(dǎo)又抑制的規(guī)律。在本研究中，高濃度組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟中GSH-PX的活性也隨之降低，而且在60 d時(shí)，隨著日糧中Cu的升高，各組也表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，這與劉慧等[23]、王凡等[24]的研究結(jié)果一致，機(jī)制可能是因?yàn)镃u含量升高，羅非魚(yú)肝臟中對(duì)谷胱甘過(guò)氧化物酶代謝外源化合物的能力已達(dá)到飽和，或者可能是過(guò)氧化氫酶(消耗H2O2比GSH-PX快)活性顯著提高，抑制了GSH-PX的活性。日糧中高Cu脅迫可促使膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)機(jī)體造成一定的損傷，同時(shí)，羅非魚(yú)肝臟和血清中SOD活性與肝臟中GSH的含量、GSH-PX活性也發(fā)生相應(yīng)變化。SOD和GSH-PX作為內(nèi)源活性氧清除劑，在高Cu的脅迫下能清除體內(nèi)過(guò)量的氧自由基，使動(dòng)物在一定程度上減緩逆境的脅迫[21,25]。但隨著Cu含量的繼續(xù)升高或脅迫時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，抗氧化酶的活性就會(huì)受到抑制，從而損傷細(xì)胞膜，降低生物的適應(yīng)性[25]。

肝臟是Cu對(duì)魚(yú)類損害的主要靶器官，同時(shí)也是脂肪代謝的重要器官，通常最容易也最常見(jiàn)的變性就是脂肪變性。一般情況下，肝細(xì)胞胞漿內(nèi)沒(méi)有脂肪滴，但如果胞漿內(nèi)脂肪增多，出現(xiàn)一些不正常的脂肪滴或超過(guò)細(xì)胞所含脂肪滴的正常范圍，則會(huì)發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變性[26]。在本實(shí)驗(yàn)中，第Ⅴ組羅非魚(yú)肝臟在第20天時(shí)就出現(xiàn)了輕微的脂肪變性，之后脂肪變性逐漸加重。第Ⅲ組和第Ⅳ組分別在第60天和第40天時(shí)也出現(xiàn)了輕微的脂肪變性。在本實(shí)驗(yàn)中，第Ⅳ、Ⅴ組在第20天時(shí)就出現(xiàn)細(xì)胞界限不清晰的現(xiàn)象，而第Ⅲ組在第40天時(shí)也出現(xiàn)了細(xì)胞界限模糊，有輕微核固縮的現(xiàn)象，其機(jī)制可能是由于Cu對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，抑制了細(xì)胞內(nèi)酶的活性，使體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，引發(fā)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞的完整性受到破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到影響。黃啟福[27]認(rèn)為，如果有比較強(qiáng)烈的有害刺激或者細(xì)胞內(nèi)壞境嚴(yán)重紊亂時(shí)，會(huì)導(dǎo)致部分生物體細(xì)胞或局部組織急劇死亡(局灶性壞死)，甚至整個(gè)肢體或器官壞死(全局性壞死)。在本實(shí)驗(yàn)中，第Ⅴ組在40天時(shí)出現(xiàn)散在的局灶性壞死，而到第60天時(shí)，局灶性壞死現(xiàn)象加重，原因可能是Cu中毒時(shí)，大量的Cu首先聚集在肝細(xì)胞核、線粒體和肝漿液中，在肝細(xì)胞溶酶體內(nèi)貯存，當(dāng)溶酶體被破壞后，Cu和水解酶被釋放出來(lái)，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起肝功能異常；如果肝臟從血液中吸收的Cu超過(guò)其貯存的限度，則可能抑制多種酶的活性，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞變性、壞死[28]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以吉富羅非魚(yú)為研究對(duì)象，分別在日糧中添加0、3、30、300、1 000、3 000 mg·kg-1Cu，研究了對(duì)其抗氧化功能、脂質(zhì)過(guò)氧化和肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響，得出以下主要結(jié)論：(1)日糧Cu脅迫條件下，膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加，羅非魚(yú)幼魚(yú)血清和肝臟中MDA的含量隨日糧中Cu含量的升高和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)顯著升高，而SOD、GSH-PX和CuZn-SOD的活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，(2)隨著暴露時(shí)間的推移和日糧中Cu含量的升高，各組間肝臟表現(xiàn)出不同程度的病變，主要是濁腫變性和脂肪變性，試驗(yàn)中第Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組均能觀測(cè)到較為嚴(yán)重的肝臟病變；(3)在本試驗(yàn)條件下，吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)日糧中Cu的實(shí)際含量不得高于42.36 mg·kg-1。

致謝：感謝廣東海洋大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系412實(shí)驗(yàn)室全體同仁，以及廣東恒興集團(tuán)湛江恒興水產(chǎn)科技有限公司、廣東吳川國(guó)聯(lián)羅非魚(yú)良種場(chǎng)對(duì)本試驗(yàn)的支持。

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Effects of Dietary Copper Stress on Antioxidation, Lipid Peroxidation and Tissue Structure of Liver in Juvenile GIFT Tilapia (Oreochromisniloticus)

Wang Wenlong1, Cui Xin1, An Lilong1,*, Xiao Mei2, #, Gao Han3, Li Chengcheng1, Xing Xing4, Li Yanwei1, Xu Yingmei1

1. Department of Animal Science, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 2. Department of Animal Medicine, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China 3. Department of Pharmaceutics, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China 4. The People’s Republic of China Qinzhou Free Trade Port Area Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinzhou 535008, China

16 Junuary 2015 accepted 17 March 2015

GIFT tilapia is an important economic species in aquaculture production in coastal regions in south of China, where is now facing an increasing challenge from Cu contamination with accelerated urbanization and industrialization. In order to evaluate the effects of dietary Cu stress on antioxidant activity and liver structure of juvenile GIFT tilapia, a total of 1 080 fishes were fed with 6 different concentrations of Cu in diets (0, 3, 30, 300, 1 000, 3 000 mg·kg-1) for 60 days. Antioxidation of serum and liver was measured, and the pathological changes of liver were observed. The results showed that the concentration of MDA in serum and liver increased significantly with exposure time and the increase of Cu accumulation in diets. Activities of SOD, CuZn-SOD and GSH-PX showed a down trend after a rise. Meanwhile, cloudy swelling and fatty degeneration in cells of liver was observed, especially pathological changes of liver aggravated when Cu concentration was increased to group Ⅲ, Ⅳ and Ⅴ. It could be concluded that dietary Cu stress depressed the antioxidant activity and damaged the liver of tilapia. Therefore, we suggest that Cu concentration in diets for juvenile tilapia should not be more than 42.36 mg·kg-1.

dietary copper stress; GIFT tilapia; pathological changes in liver; antioxidation; lipid peroxidation; cloudy swelling degeneration

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B090400376)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310566005)

王文龍(1989-)，男，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境、生態(tài)毒理學(xué)，E-mail: wangwenlong2012@yeah.net；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: anlilong@126.com;

10.7524/AJE.1673-5897.20150116001

2015-1-16 錄用日期：2015-3-17

1673-5897(2015)2-266-10

X171.5

A

安立龍(1967-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境。

效梅(1965-)，女，教授，主要從事動(dòng)物組織與胚胎工程的科研和教學(xué)工作。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: xiao0812@126.com

王文龍, 崔欣, 安立龍, 等. 日糧中銅脅迫對(duì)吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)抗氧化、脂質(zhì)過(guò)氧化及肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2015, 10(2): 266-275

Wang W L, Cui X, An L L, et al. Effects of dietary copper stress on antioxidation, lipid peroxidation and tissue structure of liver in juvenile GIFT tilapia (Oreochromis niloticus) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 266-275 (in Chinese)