問號(hào)鉤體5 6 601株外分泌蛋白功能研究

聶志文，梁振山，曾令兵

(1、上海市第一人民醫(yī)院寶山分院檢驗(yàn)科，上海200940；2、江西省兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006；3、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌330006)

鉤端螺旋體病(簡(jiǎn)稱“鉤體病”)是世界范圍內(nèi)流行的人獸共患病[1-3]。鉤體病的臨床癥狀輕重、緩急不一，輕癥患者可只表現(xiàn)為感冒樣癥狀；而重癥患者則可出現(xiàn)肝、腎、肺等多臟器的出血性病變，甚至死亡[4]。目前，鉤體病的關(guān)鍵致病因子還未完全闡明[5]。本研究在前期分泌蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上，對(duì)其中篩選得到的問號(hào)鉤體外分泌蛋白的致病功能進(jìn)行研究，為進(jìn)一步闡明問號(hào)鉤體的致病因子及致病機(jī)制提供必要的依據(jù)[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因組 由上海交通大學(xué)病原生物學(xué)教研室提供問號(hào)鉤體56601株的基因組。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 克隆菌株為E.coli DH5α，表達(dá)宿主為E.coli Bl21(DE3)，均購(gòu)于天根生物有限公司。表達(dá)載體為pET28a(+)由上海交通大學(xué)病原生物學(xué)教研室饋贈(zèng)。

1.1.3 試劑 KOD-plus購(gòu)于TOYOBO公司。限制性內(nèi)切酶及連接酶Solution I，購(gòu)于TAKARA公司。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購(gòu)于Promega公司。蛋白至分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas公司。其他試劑均為進(jìn)口分裝。

1.1.4 問號(hào)鉤體感染兔血清 該血清由上海交通大學(xué)病原生物學(xué)教研室饋贈(zèng)。由問號(hào)鉤體強(qiáng)毒株56601株，經(jīng)耳緣靜脈注射感染新西蘭兔制備獲得。

1.1.5 培養(yǎng)基 配制LB培養(yǎng)基：1%NaCl，1%胰蛋白胨以及0.5%酵母浸出液，百分比為質(zhì)量體積比。1.1.6引物 由上海Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 四個(gè)鉤體外分泌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR反應(yīng)條件如下，預(yù)變性：95℃ 2min；擴(kuò)增步驟：95℃變性 1min；55℃退火 30s；68℃延伸 1~2min(延伸時(shí)間由產(chǎn)物大小決定)；進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR引物見表1。

表1 鉤體外分泌蛋白重組克隆引物

1.2.2 獲得的PCR產(chǎn)物在相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶作用后，在連接酶Solution I的作用下，與pET28a(+)連接，最終得到攜帶有目的基因的表達(dá)載體。隨后，將相應(yīng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli Bl21(DE3)中，進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)純化過程。四個(gè)鉤體外分泌重組蛋白的表達(dá)和純化

將構(gòu)建完成的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主E.coli Bl21(DE3)中，在卡那霉素抗性(100μg/ml)平板中過夜生長(zhǎng)，挑選陽(yáng)性克隆于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按1：100擴(kuò)大培養(yǎng)。并于37℃200r/min振蕩培養(yǎng)至OD值在0.8~1.0左右，將培養(yǎng)瓶移至25℃培養(yǎng)箱中，200r/min振蕩培養(yǎng)。30min后，加入0.1mM IPTG過夜誘導(dǎo)表達(dá)。第二天，10，000r/min棄去上清液，收集菌體。 菌體加入 30ml NTA-0(150mM NaCl，50mM Tris HCl pH8.0，咪唑濃度為0mM)并充分混勻重懸，于超聲破碎儀中充分破碎菌體至清亮(功率為200~300W)，約5min。超聲破碎后，將混合液于離心機(jī)中>13,000r/min離心大于20min，棄去上清。沉淀物用NTA-0及8M脲素，充分溶解。未能溶解部分，于離心機(jī)中>13,000rpm離心20min去除。同時(shí)，Ni2+中加入NTA-0-8M脲素，室溫平衡20min。平衡后，將脲素溶解的蛋白加入到Ni2+中，隨后以不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)行SDS-PAGE，收集在目的分子量位置，條帶單一相應(yīng)管的蛋白。最后，將收集好的蛋白進(jìn)行透析及超濾濃縮至500μl左右，并測(cè)定蛋白濃度。

1.2.3 四個(gè)鉤體外分泌重組蛋白的Western Blot重組純化后得到的鉤體外分泌蛋白先進(jìn)行SDS PAGE電泳，后以100V恒定電壓，電轉(zhuǎn)1h，將SDS PAGE膠上的蛋白，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上。用封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉 1h，TBST(TBS，0.05%吐溫-20)洗膜3次，每次5min。然后，將膜與準(zhǔn)備好的1:3000稀釋的組氨酸標(biāo)記單克隆抗體 (anti-His)，或問號(hào)鉤體56601株感染兔血清于4℃反應(yīng)過夜。用TBST洗膜3次，每次5min；再與1:5000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(或兔)IgG室溫反應(yīng)30min，后以發(fā)光底物(Thermo Scientific Pierce ECL Plus Substrate)顯色。

1.2.4 鉤體外分泌蛋白體外黏附功能驗(yàn)證 將Fibronectin、Laminin、Collagen I、Collagen IV、BSA 等介質(zhì)包被在在96孔板中 (未包被孔作為空白對(duì)照)，4℃包被過夜；封閉(無(wú)蛋白封閉緩沖液，Thermo Scientific)；加入 1μg 目的蛋白，37℃作用 3h；棄去反應(yīng)液，PBST充分洗滌5遍，并拍干；加入Anti-His HRP(1:2，000)100μl；37℃反應(yīng) 1h； 棄去反應(yīng)液，PBST充分洗滌5遍，并拍干；加入100μl混合好的A、B顯色液，常溫顯色15min；終止顯色；加入50μl 1MH2SO4，終止顯色反應(yīng)；450nm 中測(cè)定其OD值。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用單因素方差分析，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 在前期問號(hào)鉤體56601株外分泌蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上，篩選得到四個(gè)可能與問號(hào)鉤體致病相關(guān)的蛋白-LA_2413、LA_2823、LA_3469 和 LB_194，其表達(dá)情況見圖1A。與56601株感染兔血清的Western Blot見圖1B。

2.2 問號(hào)鉤體56601株重組外分泌蛋白與ECMs的黏附作用，見圖2及圖3。結(jié)果顯示，LA_3469與LA_2413能夠與Laminin、Collagen I和 Collagen IV有黏附作用；而LA_3469還能夠與Fibronectin有黏附作用[14,15]。

3 討論

鉤體病是一種世界范圍內(nèi)流行的人獸共患病，其在77個(gè)國(guó)家已有報(bào)道，尤以水稻種植為主的廣大發(fā)展中國(guó)家，更為盛行。我國(guó)也是鉤體病的高發(fā)地區(qū)之一，主要集中在降水量相對(duì)充足的長(zhǎng)江中下游地區(qū)，如江西省、湖北省、四川省等省份[5]。自80年代后，我國(guó)鉤體病的發(fā)病率雖然處于逐年下降的趨勢(shì)，但是鉤體病疫區(qū)常常隨著洪水季節(jié)的到來(lái)而出現(xiàn)爆發(fā)。然而，鉤體病的致病機(jī)制及關(guān)鍵致病因子，卻未被完全闡明。并且，近年來(lái)的研究主要集中在鉤體的外膜蛋白上[7-9]，關(guān)于鉤體的分泌蛋白質(zhì)組卻鮮有報(bào)道。直至2013年，由本研究組成員首先報(bào)道了問號(hào)鉤體56601株的分泌蛋白質(zhì)組。該研究采用無(wú)蛋白培養(yǎng)基C-70，不同于鉤體的常用培養(yǎng)基EMJH和Korthof。C-70中不含有或含有微量的蛋白成分，這不僅利于富集鉤體的分泌蛋白，而且還可以避免培養(yǎng)基中的其他蛋白成分對(duì)后期的質(zhì)譜檢測(cè)造成不必要的影響。關(guān)于鉤體的無(wú)蛋白或低蛋白培養(yǎng)基，已有學(xué)者在1978年進(jìn)行了報(bào)道。該類培養(yǎng)基旨在獲得鉤體疫苗菌株，應(yīng)用于鉤體病的預(yù)防。隨后，我國(guó)的鉤體病研究學(xué)者根據(jù)該類培養(yǎng)基的特性，對(duì)鉤體無(wú)蛋白培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，最終獲得C-70培養(yǎng)基。而C-70培養(yǎng)基也同樣應(yīng)用在制備鉤體疫苗當(dāng)中。本研究的前期工作，首先評(píng)估了鉤體無(wú)蛋白培養(yǎng)基C-70對(duì)強(qiáng)毒株問號(hào)鉤體56601株的生長(zhǎng)、形態(tài)以及毒力的影響。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，C-70培養(yǎng)獲得的鉤體，其形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，與EMJH培養(yǎng)鉤體相比，并未出現(xiàn)顯著性差異。此外，C-70培養(yǎng)鉤體也保持了其感染金黃地鼠的能力[6]。隨后，我們借助56601株的全基因組及蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，對(duì)問號(hào)鉤體的分泌系統(tǒng)做了較為系統(tǒng)的分析，最終發(fā)現(xiàn)，問號(hào)鉤體具備了部分分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵元件，而尤以I、II型分泌系統(tǒng)相對(duì)完整[10]。在此基礎(chǔ)上，我們鑒定并分析了56601株的分泌蛋白質(zhì)組。隨后，我們通過鉤體感染金黃地鼠模型，比較了鑒定得到的鉤體分泌蛋白在體內(nèi)外的表達(dá)差異。最終，我們發(fā)現(xiàn)，有兩個(gè)蛋白在體內(nèi)下調(diào)表達(dá)，有15個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)。而在上調(diào)表達(dá)的蛋白中，有8個(gè)蛋白為脂蛋白。既往的研究表明，脂蛋白不僅是鉤體的重要組成成分(如LipL32等)，也是重要的致病因子，同樣，其也是非常重要的鉤體病診斷和疫苗的候選靶標(biāo)。本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)篩選得到的8個(gè)脂蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中有4個(gè)蛋白已經(jīng)被研究，而另外 4 個(gè) 脂 蛋 白 (LA_2413、LA_2823、LA_3469 和LB_194)功能并未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究對(duì)這四個(gè)脂蛋白的體外致病功能進(jìn)行了初步的分析，為進(jìn)一步篩選新的鉤體致病因子提供一定的依據(jù)。

圖1 問號(hào)鉤體56601株外分泌蛋白體外重組表達(dá)

圖2 問號(hào)鉤體56601株重組外分泌蛋白與不同細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用

圖3 LA_3469在不同濃度下與不同介質(zhì)的黏附作用

細(xì)胞外基質(zhì)(extracelular matrix，ECM)，是由動(dòng)物細(xì)胞合成并分泌到細(xì)胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白聚糖。這些物質(zhì)能夠構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，對(duì)于防御病原菌的入侵有著非常重要的作用。前期的研究表明，鉤體的部分表面暴露蛋白(主要是外膜蛋白)，能夠與宿主的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，并以此發(fā)揮一定的致病功能[7,11,12]。與此同時(shí)，致病性鉤體主要是通過破損的皮膚入侵并感染人體的，而細(xì)胞外基質(zhì)是構(gòu)成該屏障的主要組成成分。因此，本研究首先體外重組表達(dá)了這四個(gè)問號(hào)鉤體外分泌蛋白，獲得了純化的體外重組蛋白。通過體外黏附實(shí) 驗(yàn) ， 研 究 LA_3469、LA_2413、LA_2823 以 及LB_194與不同細(xì)胞外基質(zhì)的黏附功能，最終發(fā)現(xiàn)，LA_3469與LA_2413能夠與細(xì)胞外基質(zhì)Laminin、Collagen I以及Collagen IV發(fā)生黏附作用，LA_3469還能夠與Fibronectin發(fā)生黏附作用。Cao等的蛋白質(zhì)組結(jié)果中顯示，LA_3469在37oC時(shí)表達(dá)量上調(diào)，這也進(jìn)一步提示LA_3469是鉤體的一個(gè)重要的致病因子[13]。

本研究在前期問號(hào)鉤體外分泌蛋白質(zhì)組的基礎(chǔ)上，對(duì)篩選得到的體內(nèi)外表達(dá)存在差異的外分泌脂蛋白進(jìn)行了體外的功能實(shí)驗(yàn)。這為篩選鉤體的關(guān)鍵致病因子及闡明鉤體病的致病機(jī)制提供了新思路。

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