含丹參酮ⅡA磺酸鈉小鼠血清的制備及其對PCASMCs的BKCa作用的初探*

程 俊,曾曉榮,李鵬云,李妙齡,劉智飛,裴 杰,楊 艷

(瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理學(xué)研究室，四川瀘州 646000)

·論著·

含丹參酮ⅡA磺酸鈉小鼠血清的制備及其對PCASMCs的BKCa作用的初探*

程 俊,曾曉榮,李鵬云,李妙齡,劉智飛,裴 杰,楊 艷△

(瀘州醫(yī)學(xué)院心肌電生理學(xué)研究室，四川瀘州 646000)

目的 探討一種將中藥血清藥理學(xué)和電生理學(xué)技術(shù)結(jié)合的方法，并將該方法運(yùn)用到中藥丹參的有效成分丹參酮ⅡA磺酸鈉(DS-201)的舒血管機(jī)制研究。方法 采用醇提法提取丹參有效成分，將該提取液給予小鼠灌胃，經(jīng)眼球采血得到小鼠血清，用高效液相色譜法(HPLC)測定小鼠血清中DS-201的含量，并將該含藥血清應(yīng)用于單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)，研究其對豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PCASMCs)大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的作用。結(jié)果 含DS-201血清濃度線性范圍是0.73～1.91 μg/mL (r=0.997 7)，回收率是99.85%～101.47%，血藥濃度為(7.32±4.25)μg/mL；單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠含DS-201血清對PCASMCs的BKCa有激活作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 該研究建立的提取丹參有效成分丹參酮的醇提法簡單、實(shí)用、可靠，且測定DS-201含量的HPLC方法精確；應(yīng)選取高質(zhì)量丹參和(或)提高丹參在體內(nèi)的生物利用度，才能更好地將血清藥理學(xué)和電生理學(xué)技術(shù)結(jié)合在一起。

丹參；丹參酮ⅡA磺酸鈉；高效液相色譜法；血清藥理學(xué)；膜片鉗技術(shù)

中藥血清藥理學(xué)方法是將中藥和(或)中藥復(fù)方經(jīng)口灌胃動(dòng)物一段時(shí)間之后，經(jīng)靜脈或眼球等方式采集血液、得到血清，再用該含藥物的血清進(jìn)行其他體外實(shí)驗(yàn)，是一種半體內(nèi)半體外的實(shí)驗(yàn)方法[1]。用含藥血清代替中藥煎劑或中藥粗制提取物進(jìn)行動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)，是最近20年才新興起來的一種方法學(xué)。其優(yōu)點(diǎn)在于排除了中藥煎劑或中藥粗制提取物本身的化學(xué)物質(zhì)對體外實(shí)驗(yàn)的干擾，還可以反映中藥在體內(nèi)的各種生物化學(xué)轉(zhuǎn)化效應(yīng)，比直接把中藥煎劑或中藥粗制提取物直接應(yīng)用于體外實(shí)驗(yàn)更科學(xué)、更客觀[2]。膜片鉗技術(shù)在國內(nèi)國際上都是一種新型的先進(jìn)技術(shù)，它是通過對各種離子通道動(dòng)力學(xué)的觀察，從而闡明中藥對細(xì)胞的作用機(jī)制，因此將中藥血清藥理學(xué)和膜片鉗技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用研究中藥的各種作用機(jī)制，將為中藥的機(jī)制研究和應(yīng)用開辟廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)以中藥丹參為例，建立提取丹參有效成分的醇提法和丹參提取液灌小鼠胃后小鼠血清中丹參酮ⅡA磺酸鈉(DS-201)含量的高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測法，并監(jiān)測實(shí)驗(yàn)中小鼠血藥濃度，再觀察含DS-201小鼠血清對豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PCASMCs)上大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCa)的作用，希望通過建立中藥血清藥理學(xué)方法和電生理技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的方法，對丹參舒血管的電生理機(jī)制進(jìn)行更深入的探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 HPLC儀1套；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，電子天平(Sartorius公司，Swiss)；CEZ-2200型膜片鉗系統(tǒng)(Nihon Kohoen公司，Japan)1套；PC-10玻璃微管拉制儀(Narishige公司，Japan)，pCLAMP 6.0和10.1分析軟件(Axon公司，USA)各1套。丹參藥材(瀘州市寶光藥房)；DS-201對照品(批號：110766-200315)和卡馬西平對照品均購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈和甲醇為色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠(昆明種屬)，體質(zhì)量25～35 g，均來自瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不拘。豬心取自瀘州市屠宰場。

1.3 丹參提取液的制備 稱取一定量的丹參原生藥，用5倍量70%乙醇浸泡3 d后，用8層紗布過濾，濾液用60 ℃恒溫水浴箱蒸發(fā)成1.1∶1.0的濃度，用濾紙過濾后再蒸發(fā)；藥渣再用5倍量70%乙醇浸泡2 d，再用8層紗布過濾，濾液用60 ℃恒溫水浴箱蒸發(fā)成1.1∶1.0的濃度，用濾紙過濾后再蒸發(fā)，濾渣再水煎30 min，過濾蒸發(fā)，再用濾紙過濾、蒸發(fā)，與前2次醇提藥液混合，蒸發(fā)至乙醇全無。

1.4 含藥血清的制備 小鼠給藥量用以下公式計(jì)算，給藥量=臨床用量×動(dòng)物等效面積系數(shù)×浴槽內(nèi)血清稀釋度[3]。小鼠按195 g·kg-1·d-1，采用“通法” 方法給藥，即每天2次給藥，連續(xù)給藥3 d和(或)7 d，最后一次給藥0.5 h后摘眼球取血[4]。血液室溫靜置5 min后，以2 500 r/min速率離心25 min，取血清于56 ℃恒溫水浴箱中進(jìn)行30 min的滅活處理，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)液的配備 精確稱量DS-201對照品，用超純水溶解，配成一系列DS-201標(biāo)準(zhǔn)液，于4 ℃儲存。另外稱取卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)，用乙腈溶解，終濃度為2.08 μg/mL，儲存于4 ℃冰箱，備用[5]。

1.6 血清樣品制備 將100 μL血清樣品和150 μL內(nèi)標(biāo)液吸取至1.5 mL離心管中，震蕩混勻，再以15 000 r/min速率離心10 min，留取上清液[5]。

1.7 色譜條件 流動(dòng)相為甲醇-水，80∶20，柱溫為30 ℃，流速為1.00 mL/min，波長270 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和小鼠血清中DS-201含量測定 將“1.5”項(xiàng)配成的一系列的DS-201標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL和空白血清90 μL，配成濃度為40、80 μM DS-201血清樣品各3份，按照“1.6”項(xiàng)處理血清樣品，按照“1.7”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測定。把DS-201標(biāo)準(zhǔn)液濃度設(shè)成橫坐標(biāo)即X軸，把樣品的峰高和內(nèi)標(biāo)的峰高之比設(shè)成縱坐標(biāo)即Y軸，線性回歸即可得標(biāo)準(zhǔn)曲線。取以上制備好的含DS-201血清樣品100 μL，按照“1.6”項(xiàng)方法處理，進(jìn)樣，測定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線精確計(jì)算出血清中DS-201濃度[5]。

1.9 含DS-201血清對PCASMCs上BKCa的作用

1.9.1 溶液Ⅰ成分(mmol/L) NaCl 127.00，KCl 5.90，MgCl21.20，Glucose 12.00，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)10.00，CaCl22.40。pH用NaOH調(diào)至7.40[6]。

1.9.2 溶液Ⅱ成分(mmol/L) NaCl 127.00，KCl 5.90，MgCl21.20，Glucose 12.00，HEPES 10.00。pH用NaOH調(diào)至7.40[6]。

1.9.3 電極液成分(mmol/L) K-Asp 40.00，KC1 100.00，HEPES 10.00，CaCl2,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入相應(yīng)劑量。pH用KOH調(diào)至7.20[5]。

1.9.4 細(xì)胞浴液成分(mmol/L) K-Asp 100.00，KCl 40.00，HEPES 10.00，EGTA 1.00，CaCl20.55。pH用KOH調(diào)至7.20[5]。

1.9.5 酶液[7]酶Ⅰ成分(mg/mL)：木瓜蛋白酶 1.0，二硫蘇糖醇 0.68，清蛋白2.00，用溶液Ⅱ溶解；酶Ⅱ成分(mg/mL)：F型膠原酶1.615，用溶液Ⅱ溶解。

1.9.6 單通道膜片鉗實(shí)驗(yàn) 取回豬心，在溶液Ⅰ中游離出單根的冠狀動(dòng)脈，用眼科剪將游離出的動(dòng)脈縱行剖開，將其放入盛有溶液Ⅱ的培養(yǎng)皿中剪成2 mm×2 mm×1 mm的動(dòng)脈條塊。將該動(dòng)脈條塊放入盛有酶液Ⅰ的玻璃小瓶中，在37 ℃恒溫水浴箱中振蕩消化約9 min；再取出組織塊放入盛有酶液Ⅱ的玻璃小瓶中繼續(xù)消化約6 min，然后取出組織塊放入盛有溶液Ⅱ的玻璃小瓶中，用玻璃吸管輕輕吹打，將細(xì)胞懸液滴于載玻片上，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。若在低倍視野(10×10)下能找到8～10個(gè)單個(gè)的PCASMCs細(xì)胞，且細(xì)胞膜表面光滑、折光性好、立體感強(qiáng)，即可終止消化[8]。在室溫下，將PCASMCs放在浴槽中，浴液灌流10 min，在倒置顯微鏡下找到單個(gè)貼壁性好的細(xì)胞，利用微推進(jìn)器將電極尖端向細(xì)胞靠近，給予負(fù)壓，形成高阻封接，阻抗達(dá)10～100 GΩ，即成為細(xì)胞貼附式膜片，用推進(jìn)器將電極尖端提出浴液，于空氣中暴露2～3 s，重新放回浴液，即形成內(nèi)面向外式膜片[9-10]。以DS-201標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，比較含DS-201小鼠血清對PCASMCs的BKCa的作用。在血清中加入5 mmol/L EGTA處理，以排除血清中Ca2+對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾[11]。

2 結(jié)果

2.1 灌胃液中DS-201的含量 由于提取的灌胃液較黏稠，而且含糖量較高，不易稀釋，本研究采用稱量的方法計(jì)算其含量。灌胃液中DS-201的含量為20.28 μg/g，密度為1.29 g/mL，濃度為89.93 μmol/L。此濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于張潔等[12]報(bào)道的DS-201在PCASMCs內(nèi)面向外式膜片上的有效濃度(5～20 μmol/L)，也高于Yang等[13]報(bào)道的DS-201在PCASMCs內(nèi)面向外式膜片上的有效濃度(40～80 μmol/L)。

2.2 HPLC結(jié)果

2.2.1 HPLC色譜 在設(shè)定的色譜條件下，小鼠血清樣品、小鼠血清對照品和內(nèi)標(biāo)液的色譜圖見圖1。

1峰：基線；2峰：含DS-201血清；3峰：空白血清+標(biāo)準(zhǔn)品；4峰：內(nèi)標(biāo)。

圖1 小鼠血清高效液相色譜圖

A：空白對照組(空白血清)；B：含DS-201血清；C：40 μmol/L DS-201標(biāo)準(zhǔn)品；D：80 μmol/L DS-201標(biāo)準(zhǔn)品(溶液中游離Ca2+濃度為10-7mol/L，膜電位為+40 mV)。

圖2 DS-201對PCASMCs的BKCa的作用

2.2.2 丹參提取液灌胃后小鼠血清中DS-201濃度 小鼠血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.48+0.38X(r=0.997 7)，計(jì)算得出小鼠血清中DS-201濃度范圍為0.73～1.91 μg/mL[14]，該濃度不能達(dá)到DS-201在PCASMCs內(nèi)面向外式膜片上的有效濃度，延長灌胃時(shí)間仍然沒有升高血清中DS-201濃度。

2.3 含DS-201小鼠血清對PCASMCs的BKCa作用的初步觀察 在PCASMCs的內(nèi)面向外膜片上，陽性對照DS-201標(biāo)準(zhǔn)品在40 μM和80 μM濃度下均都顯著激活BKCa(n=9)。用本文所述丹參提取液灌胃小鼠3 d或7 d后的含DS-201血清對PCASMCs上BKCa沒有顯著激活作用(n=15)，如圖2所示。

3 討論

1984年召開的第1屆漢醫(yī)藥學(xué)會(huì)上，日本學(xué)者Iwama等[15]首次提出將含藥血清替代中藥煎劑或中藥粗制提取物用在動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)的概念。1988年，日本學(xué)者田代真一首次提出血清藥理學(xué)這一概念。經(jīng)過20年的發(fā)展，血清藥理學(xué)這一新型的方法已經(jīng)廣泛運(yùn)用到各種科研領(lǐng)域中，但將中藥血清藥理學(xué)應(yīng)用于電生理學(xué)的研究還很少，因此本研究嘗試建立一種中藥血清藥理學(xué)和膜片鉗技術(shù)研究離子通道動(dòng)力學(xué)二者聯(lián)合應(yīng)用的嶄新方法，用來解決傳統(tǒng)中藥研究中只能給予中藥單體有效成分進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的局限性，進(jìn)一步擴(kuò)展到復(fù)方制劑也可應(yīng)用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)，這將大大擴(kuò)大了中藥研究領(lǐng)域。

小動(dòng)脈與微動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞的收縮活動(dòng)產(chǎn)生血管張力，位于其上的離子通道發(fā)揮著重要的作用，而作為平滑肌細(xì)胞主要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器的BKCa則在平滑肌舒張調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BKCa激活后，可負(fù)反饋引起血管舒張，許多舒血管活性物質(zhì)都可以通過對該通道的激活而發(fā)揮作用。DS-201具有舒張血管效應(yīng)，廣泛應(yīng)用于臨床，因此，把BKCa作為該實(shí)驗(yàn)的觀察指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)將丹參生藥以195 g·kg-1·d-1劑量灌胃小鼠3 d或7 d后，其含DS-201血清都對PCASMCs的BKCa無顯著激活作用，而陽性對照DS-201標(biāo)準(zhǔn)品在40、80 μM均可顯著激活該通道與Tan等[16]結(jié)果一致。結(jié)果表明，含DS-201小鼠血清不能有效激活BKCa，與用HPLC法測量的小鼠血清中DS-201含量低一致。中藥血清藥理學(xué)有這樣的觀點(diǎn)，中藥煎劑或粗制提取物經(jīng)口灌胃后，再經(jīng)腸道吸收，肝臟代謝后進(jìn)入血液，其有效成分到達(dá)各臟器發(fā)揮藥效，另外還有其內(nèi)生成分發(fā)揮作用。本研究結(jié)果表明，中藥丹參提取液灌胃小鼠后血清中沒有可以激活BKCa的內(nèi)生性有效成分產(chǎn)生，或用膜片鉗方法不能有效檢測出能顯著激活PCASMCs上BKCa的物質(zhì)。

HPLC結(jié)果顯示，經(jīng)3 d或7 d灌胃后小鼠血清中含DS-201有效濃度太低，無法達(dá)到激活PCASMCs上BKCa的DS-201最低濃度(5 μmol/L)。為了進(jìn)一步提高小鼠血清中有效藥物濃度，作者采取給予小鼠最大藥物劑量灌胃，使其達(dá)到小鼠最大耐受量，并延長灌胃時(shí)間，最長達(dá)到15 d，增加灌胃次數(shù)，仍然不能達(dá)到小鼠血清中有效藥物濃度。因此，為了能使膜片鉗技術(shù)和中藥血清藥理學(xué)方法有效地結(jié)合起來，今后的研究中需要進(jìn)一步提高小鼠血清中有效藥物濃度。因此，需要選用高質(zhì)量的中藥材、促進(jìn)藥物在機(jī)體內(nèi)的吸收、提高藥物在機(jī)體內(nèi)的生物利用度[5]。這將為以后研究中藥單體及復(fù)方制劑提供一個(gè)新思路。

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Preparation and measurement of sodium tanshinoneⅡ-A sulfonate in mice serum and effects on big conductance calcium-activated potassium channels in porcine coronary artery smooth muscle cells*

ChengJun,ZengXiaorong,LiPengyun,LiMiaoling,LiuZhifei,PeiJie,YangYan△

(InstituteofMyocardialElectrophysiology,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To discuss a method combining serum-pharmacology and electrophysiology technology,and to research the mechanism of dilating porcine coronary artery of sodium tanshinoneⅡ-A sulfonate (DS-201).Methods To give mice intragastric administration solution and measure DS-201 concentration in mice serum,and apply the serum to single channel patch to research its effect on big conductance calcium-activated potassium channels(BKca) in porcine coronary artery smooth muscle cells(PCASMCs).Results The linear range of concentration containing DS-201 serum was 0.73 to 1.91 μg/mL (r=0.997 7),the recycle rate was 99.85%-101.47%,and the concentration was(7.32±4.25)μg/mL;the result indicates that serum containing DS-201 has activation effects on BKCain PCASMCs,while there was no statistical significance (P>0.05).Conclusion The establishment method of the alcohol extraction of Danshen is useful and reliable.The HPLC method of measuring DS-201 concentration is precise.Choosing higher quality drugs or raising bioavailability can improve combination of the serum pharmacology and electrophysiological technique.

salvia miltiorrhita;sodium tanshinoneⅡ-A sulfonate;high efficiency liquid chromatography;serous pharmacology;patch clamp technique

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.04.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173661)；四川省教育廳自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(10ZB123)。 作者簡介：程俊(1977-)，副研究員，碩士，主要從事心血管電生理研究。△

,E-mail：wyangyan@gmail.com。

R285.5

A

1671-8348(2015)04-0436-03

2014-09-03

2014-10-25)