裸鼠肝包膜下輸注DC-CIK細胞抑制脾內(nèi)腫瘤和肝轉移瘤生長的初步研究

徐兵吳林嵐黃素欽楊曉梅吳開木

作者單位：350025 福州1福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所；350001 福州2福建省第二人民醫(yī)院檢驗科專家組；3福州市菁華崇輝醫(yī)院內(nèi)科

基礎研究

裸鼠肝包膜下輸注DC-CIK細胞抑制脾內(nèi)腫瘤和肝轉移瘤生長的初步研究

徐兵1吳林嵐2黃素欽1楊曉梅3吳開木2

作者單位：350025 福州1福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院肝病研究所；350001 福州2福建省第二人民醫(yī)院檢驗科專家組；3福州市菁華崇輝醫(yī)院內(nèi)科

目的建立一種肝臟靶向輸注免疫效應細胞法，用于抑制脾內(nèi)腫瘤和肝轉移瘤生長。方法 將一空心纖維墊置于接種SW480腫瘤模型裸鼠肝包膜下，形成肝包膜下人工囊腔；從人外周血單核細胞誘導出細胞因子誘導殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）。體外檢測CIK對SW480細胞殺傷率，并使DC負載SW480細胞抗原。將共同培養(yǎng)的效應細胞（DC-CIK）注入模型裸鼠肝包膜下人工囊腔（A組，20只）和尾靜脈（C組，20只），每只6×107個/0.3m l；同法對20只模型裸鼠分別注入生理鹽水，0.3m l/只，并分為B組、D組各10只（作為A組、C組的對照）。每周注射2次，共注射4周。末次注射后48 h，檢查比較A組和C組脾內(nèi)原發(fā)腫瘤體積、抑瘤率和肝組織病理切片轉移瘤灶均數(shù)。結果 效靶比為60∶1時CIK對SW480細胞殺傷率為（75.3±8.42）%。CIK的CD3/CD56表達率為（36.4±13.2）%。治療后，A組和C組的抑瘤率分別為32.07%和16.54%（P＜0.05）；A組和C組肝組織切片轉移瘤灶均數(shù)分別為（2.47±1.02）個和（5.05±1.06）個（P＜0.01）。結論 裸鼠肝包膜下輸注DC-CIK可明顯抑制脾內(nèi)腫瘤和肝轉移瘤生長，抑瘤效果優(yōu)于尾靜脈注射DC-CIK。

肝腫瘤；脾臟腫瘤；細胞因子誘導殺傷細胞；樹突狀細胞；包膜；裸鼠

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine induced killer，CIK）是一種新興的過繼免疫療法。用效應細胞（DC-CIK）防治腫瘤要求DC-CIK聚集在靶細胞（癌細胞）附近，且效靶細胞數(shù)比例要足夠大。目前臨床主要通過靜脈輸注DCCIK，使之廣泛分布于全身大部分器官，但分布的多少與血運豐富程度、器官免疫屬性和流經(jīng)次序有關，難以靶向聚集在某一臟器。有報道將DC-CIK輸注在腫瘤周圍，其抑瘤效果優(yōu)于靜脈輸注［1］，但局部輸注存在穿刺損傷、癌細胞播散等問題。本研究在裸鼠肝包膜下預構一人工囊腔，通過人工囊腔將DC-CIK輸注到肝包膜下肝實質(zhì)表面，建立一種微創(chuàng)肝臟靶向輸注法，用以抑制脾內(nèi)腫瘤細胞的生長和肝轉移，證明本法的可行性和有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細胞

SPF級BALB/c-nu小鼠60只，雄性，鼠齡7～8周，體重（25±2）g，購自上海斯萊克實驗動物公司（合格證號：SCXK滬2007-0005）。人結腸腺癌細胞株SW480購自中科院上海細胞研究所，細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換液，4 d傳代一次。

1.2 主要試劑、儀器和材料

RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Hyclone公司）。rh IL-2、rh IFN-γ（美國Pepro Tech公司）。人CD3單抗（美國ebioscience公司）。rhGM-CSF、rIL-4（美國R&D公司）。淋巴細胞分離液（上海生化試劑二廠）。異硫氰酸熒光素/藻紅蛋白（FITC/PE）標記的鼠抗人CD單抗和流式細胞術儀（美國BD公司）?？招睦w維墊（用威海威高血液凈化制品公司W(wǎng)G-F50-PP空心纖維血漿分離器的聚丙烯空心纖維纏繞自制）。

1.3 CIK細胞的誘導和擴增

采集健康獻血者抗凝外周血液50ml，用淋巴細胞分離液密度梯度離心，分離外周血單個核細胞（PBMC），用完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液）調(diào)整細胞濃度為5×106個/m l，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h。收集非貼壁細胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，加入IFN-γ 1 000 U/ml，置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，加入人CD3單抗（終濃度為100 ng/ml）和IL-2（終濃度為300 U/ml）繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d半量換液一次，補足細胞因子［2］。

1.4 DC細胞的誘導和擴增

取上述留有貼壁細胞的25ml培養(yǎng)瓶，加入DC培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、1 000U/mlGM-CSF和500U/ml IL-4的RPMI 1640培養(yǎng)液）15 ml/瓶；置37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日全量換液并補足細胞因子［2］。

1.5 用SW 480腫瘤抗原對DC體外沖擊致敏

將SW480腫瘤細胞濃度調(diào)為2×107個/ml，經(jīng)液氮和37℃反復凍融4次，離心取上清液過濾除菌，即為SW480腫瘤抗原溶液。收集上述誘導培養(yǎng)8 d的DC，以DC∶SW480腫瘤抗原=1∶10（細胞數(shù)比例）加入上述凍融抗原，繼續(xù)培養(yǎng)16 h，即為負載SW480腫瘤抗原的DC［3］。

1.6 DC細胞和CIK細胞共培養(yǎng)

將上述負載SW480腫瘤細胞抗原的DC細胞和同期CIK細胞按1∶5比例混合，用CIK培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、IFN-γ1 000 U/ml、人CD3單抗100 ng/m l、IL-2 300 U/ml的RPMI 1640培養(yǎng)液）共培養(yǎng)4 d，用于輸注裸鼠［2］。

1.7 鼠尾膠原凝膠的制備

收集鼠尾置75%乙醇中浸泡30 min；無菌條件下撕下尾腱，剪碎。取1.5 g尾腱碎片浸入150ml 0.1%醋酸中，置4℃冰箱，用磁力攪拌器攪拌48 h，離心收集上清液干燥后稱重，用0.1%醋酸溶解為20 g/L膠原溶液。臨用前用1mol/LNaOH將膠原溶液pH值調(diào)為7.4，待成黏稠膠狀即可使用［4］。

1.8 裸鼠荷瘤模型的建立及動物分組

將處于對數(shù)生長期的SW480瘤細胞用0.9%NaCl溶液配成1×107個/ml無菌細胞懸液（用臺盼藍拒染法測細胞活率>95%）。裸鼠用40 g/L水合氯醛（10ml/kg）腹腔注射麻醉。手術開腹，在脾臟下極的包膜下緩慢注入腫瘤細胞懸液0.1 ml（時間>2min）。提起肝包膜，用眼科鑷刺入潛行分離出肝包膜下間隙，切開肝包膜將空心纖維墊塞進肝包膜下（形成肝包膜下人工囊腔），縫合肝包膜并用膠原凝膠涂封肝包膜全表面；將腹壁切口肌層縫合于兩邊皮下組織，使人工囊腔的肝包膜貼近皮下，縫合皮膚關腹。這樣可在腹部只隔皮膚觸及人工囊腔，便于向肝包膜下人工囊腔內(nèi)注射。接種腫瘤細胞后的裸鼠在嚴格無菌條件下飼養(yǎng)。將60只荷瘤裸鼠模型隨機分為4組：A組20只，B組10只，C組20只，D組10只。接種腫瘤細胞建模后2 d，經(jīng)皮穿刺以肝包膜下人工囊腔中的空心纖維墊為引導，將DC-CIK（6×107個/0.3 ml）、生理鹽水0.3 ml分別注入A組、B組人工囊腔（分布于肝實質(zhì)表面）；將DC-CIK（6×107個/0.3ml）、生理鹽水0.3 ml分別注入C組、D組尾靜脈。每周注射2次，共注射4周［5］。末次注射后48 h處死裸鼠，檢測腫瘤情況。

1.9 CIK和DC細胞表型鑒定

用流式細胞術儀檢測培養(yǎng)淋巴細胞的CD3/CD56、CD3/CD8表達率以鑒定 CIK。檢測 CD1a、CD83、CD1a/CD83、CD86/HL-DR的表達率以鑒定DC。

1.10 CIK細胞體外殺瘤細胞活性的檢測

以SW480腫瘤細胞為靶細胞接種于96孔板中，104個細胞/孔；以CIK細胞為效應細胞，按效靶比20∶1、40∶1、60∶1將CIK細胞加入各孔中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)結束前4 h，加入四甲基偶氮唑藍（MTT，5 mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，此為實驗組。另設立單一效應細胞組、單一靶細胞組及空白對照組。每組設3個復孔。用酶標檢測儀測定各孔492 nm的吸光度A值，按以下公式計算：細胞殺傷率（%）=［1-（實驗組A值-效應細胞組A值）/靶細胞組A值］×100%。

1.11 脾內(nèi)原發(fā)瘤和肝轉移瘤灶檢測

摘眼球取血頸椎脫臼處死裸鼠，切開脾臟完整取出腫瘤，用游標卡尺測量腫瘤最大徑（a）和最小徑（b），計算腫瘤體積（V）=ab2/2；以A組、C組為實驗組，B組、D組為相應的對照組，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組平均體積-治療組平均體積）/對照組平均體積×100%。取裸鼠肝臟連續(xù)切片做病理檢查，按4個等級計數(shù)肝轉移瘤灶：0級（肝臟無轉移灶），Ⅰ級（1～5個轉移灶），Ⅱ級（6～10個轉移灶），Ⅲ級（＞10個轉移灶）［5］。

1.12 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，兩組百分率比較用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CIK細胞表型

誘導13 d的CIK細胞CD3/CD56雙陽性表達率為（36.4±13.2）%，未經(jīng)誘導淋巴細胞的相應表達率為（6.7±3.2）%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），誘導后CD3/CD8雙陽性表達率為（43.5±15.5）%，誘導前淋巴細胞為（28.5±2.6）%。誘導前后結果比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 DC細胞表型

誘導7 d的DC細胞CD1a（DC特異性指標）、CD83（DC成熟指標）、CD1a/CD83雙陽性、CD86/HLDR雙陽性表達率均比誘導前有較大升高。提示本實驗培養(yǎng)出成熟的DC。見表1。

表1 誘導7 d的DC和誘導前淋巴細胞表面CD分子的表達率［（±s），%］

表1 誘導7 d的DC和誘導前淋巴細胞表面CD分子的表達率［（±s），%］

△與誘導前淋巴細胞比較，P均＜0.05。

指標 n DC 誘導前淋巴細胞CD1a 10 57.62±7.16△1.79±0.57 CD83 10 80.70±8.31△2.78±0.42 CD1a/CD83 10 55.73±6.26△1.75±0.53 CD86/HL-DR 10 31.52±4.38△3.39±1.89

2.3 CIK細胞體外殺瘤細胞活性

CIK對SW480腫瘤細胞的殺傷率隨效靶細胞比的增加而上升，以60∶1的殺傷效果最好，達（75.3±8.42）%，但與其他組比較無明顯差異（P均＞0.05）。見表2。

表2 不同效靶比CIK細胞對SW 480腫瘤細胞的殺傷率［（±s）%］

表2 不同效靶比CIK細胞對SW 480腫瘤細胞的殺傷率［（±s）%］

△與20∶1組或40∶1組比較，P均＞0.05。

CIK：SW480 n 腫瘤細胞死亡率20∶1 6 60.4±4.43 40∶1 6 72.5±7.27 60∶1 6 75.3±8.42△

2.4 脾內(nèi)原發(fā)腫瘤的檢測

A組、B組、C組、D組都有1只裸鼠未成瘤，總成瘤率為93.3%。治療后，A組腫瘤平均體積明顯小于C組腫瘤平均體積（P＜0.05）。A組抑瘤率明顯高于C組抑瘤率（P＜0.05）。見表3。

表3 治療后各組裸鼠脾內(nèi)原發(fā)腫瘤體積及抑瘤率

2.5 肝轉移瘤檢查

各組按肝組織切片轉移瘤灶數(shù)量分成4級，A組的0級（無轉移瘤）裸鼠數(shù)量明顯多于其余組相應值；A組的轉移瘤灶均數(shù)明顯少于C組、B組和D組相應值（P均＜0.05）。見表4。

表4 各組按肝組織切片轉移瘤灶數(shù)量分級的裸鼠數(shù)量和瘤灶均數(shù)［（±s），個］

表4 各組按肝組織切片轉移瘤灶數(shù)量分級的裸鼠數(shù)量和瘤灶均數(shù)［（±s），個］

▲分別與B組、C組或D組比較，P均＜0.05。

組別 n 0級 Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅲ級 瘤灶均數(shù)A組 19 8 8 2 1 2.47±1.02▲B組 9 0 2 3 4 8.39±2.45 C組 19 4 6 6 3 5.05±1.06 D組 9 1 1 2 5 8.56±2.37

3 討論

肝癌患者常伴有肝功能損害和免疫功能低下，使化療和放療難以進行，故對中晚期肝癌患者目前主要采用物理或生物療法輔助治療。其中生物療法對癌細胞靶向性強，可提高機體免疫功能，尤適用于清除手術后殘余和早期轉移的癌細胞。目前用免疫效應細胞（DC、CIK等）治療腫瘤的主要途徑有皮下和靜脈注射，但二者均存在輸注的細胞難以在腫瘤組織內(nèi)大量聚集的缺點［6，7］。有報道將效應細胞直接注入瘤周，發(fā)現(xiàn)抑瘤效果優(yōu)于靜脈或腹腔輸注［1］。但是瘤周或瘤內(nèi)注射有可能引發(fā)醫(yī)源性腫瘤細胞播散的危險。在動物實驗中，穿刺實體瘤大約可引起1010個腫瘤細胞的種植，并可導致85%的腫瘤細胞種植性生長［8］。即使用細針穿刺進行原發(fā)性肝癌活檢，穿刺道的種植轉移發(fā)生率也在1%～5%之間［9，10］。這是所有腫瘤局部穿刺的固有缺點。為了實現(xiàn)臟器靶向給藥，避免腫瘤局部穿刺，本研究將效應細胞輸注于肝包膜下肝實質(zhì)表面，用于防治肝內(nèi)腫瘤。依據(jù)是，有文獻證實腹腔內(nèi)移植的同位素標記CIK細胞可遷移到肝、腸、胃、肺等臟器，而且在這些臟器的分布比值高于通過靜脈途徑的分布比值［1，11］。提示CIK細胞可穿過生物膜、組織細胞間隙而遷移。本研究將DC-CIK注于肝實質(zhì)表面，使效應細胞直接與肝細胞接觸。根據(jù)肝臟豐富的血供和免疫效應細胞的遷移特性，使移植的效應細胞生長并進入肝內(nèi)血循環(huán)。

小鼠或人的肝包膜由較厚的纖維性內(nèi)層（Glisson包膜）和漿膜外層（腹膜）構成，內(nèi)層包膜完整包裹整個肝臟，而漿膜層則覆蓋除肝裸區(qū)、肝門、膽囊附近外的肝臟。由于這兩層結構，肝包膜比其他腹腔臟器包膜更厚實，也較易剝離。肝包膜與肝實質(zhì)之間有潛在腔隙，外傷時可容納大量血液、體液。作者曾報道將膠原溶液注入肝包膜下變成膠原凝膠，使肝包膜和肝實質(zhì)之間形成一人工囊腔，由此將大鼠自體骨髓干細胞注入肝包膜下，用于治療大鼠肝功能損傷［4］。提示肝包膜下環(huán)境接近于肝內(nèi)環(huán)境。本實驗將空心纖維墊置于肝包膜下，在肝包膜和肝實質(zhì)表面間形成人工囊腔。將腹壁切口兩邊肌層縫接于皮下組織，使肝包膜（人工囊腔）貼近皮下（可在裸鼠腹部隆起處觸及），便于經(jīng)皮向肝包膜下注射（可借助B超引導），使DCCIK細胞直達肝實質(zhì)表面，并沿著肝包膜下間隙擴散到大部分肝實質(zhì)表面，從而使更多DC-CIK細胞進入肝組織。本研究輸注于肝包膜下的DC-CIK細胞，可明顯抑制脾內(nèi)原發(fā)瘤生長，且抑制瘤細胞向肝轉移。提示輸注于肝包膜下的DC-CIK已進入肝內(nèi)和脾臟并發(fā)揮抑瘤作用。本研究A組肝包膜下輸注的DC-CIK理論上可全部進入肝臟，然后再分布到其他臟器。而C組尾靜脈輸注的DC-CIK僅約1/6分布于肝臟［1］。故推測A組肝內(nèi)DC-CIK細胞密度應遠高于C組，使A組肝轉移瘤數(shù)量明顯少于C組。由于脾臟與肝臟鄰近，血供也密切相關，故A組脾內(nèi)DC-CIK密度也會高于C組，使A組脾內(nèi)原發(fā)瘤體積也明顯小于C組。人工囊腔中纖維墊所用的聚丙烯為生物惰性材料，對組織刺激性小。也可用生物可降解材料制成纖維墊，或用可注射凝膠（如膠原溶液）經(jīng)腹腔鏡注入肝包膜下形成人工囊腔。

目前認為DC是功能最強的抗原提呈細胞。GMCSF是維持DC生長和分化的基本細胞因子。IL-4可促使單核細胞轉化為成熟DC。本研究在DC成熟過程中，用SW480腫瘤細胞凍融抗原沖擊致敏，致敏成熟DC可將腫瘤細胞抗原提呈給CIK，幫助CIK通過黏附因子LFA/ICAM-1與腫瘤細胞特異結合，引發(fā)細胞毒和免疫調(diào)理功能（本實驗所用的CIK中CD3+/CD56+細胞為36.4%，大于20%的成熟標準）。CIK同時表達CD3+/CD8+，提示CIK具有NK細胞和T細胞的標志，兼有這兩種細胞殺瘤活性。

總之，本實驗提示肝包膜下輸注DC-CIK細胞對肝臟創(chuàng)傷較小，且不易使腫瘤細胞擴散，并可使DCCIK濃集于肝臟。但多次注射易損傷肝包膜，可預將一硅化管道插入人工囊腔，管道外端與埋于皮下的注射接頭接通，使用時經(jīng)皮通過皮下接頭和管道向人工囊腔注射［12］。有關方面有待進一步研究。

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［2015-01-15收稿］［2015-05-03修回］［編輯 江德吉］

Prelim inary analysis of the effects of injecting DC-CIK cells into the liver subcapsule to suppressgrow th of primary sp leen tumorsand metastatic liver tumors in a nu-mousemodel

XU Bing1，WU Linlan2，HUANG Suqing1，YANG Xiaomei3，WU Kaimu2（1Institute of Liver Diseases，Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350025，P.R.China；2The Second People′s Hospital of Fujian Province；3Fuzhou Jing-hua Chonghui Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，P.R.China）

Xu Bing.E-mail：xubing1228@163.com

Objective To develop amethod for injecting immune cells that target the liver and suppress tumor growth there.M ethod A hollow fiber pad was placed into the liver subcapsule of nu-mice bearing SW480 tumors，leading to cyst formation in the subcapsule.Dendritic cells（DCs）and cytokine-induced killer cells（CIKs）were induced from human peripheral blood monocytes.The ability of CIKs to inhibit SW480 cell proliferation wasmeasured.DCs were loaded with antigens from SW480 cells，and co-cultured with CIKs.DC-CIK co-cultureswere injected into the subcapsule cyst or into the caudal vein（6×107cells in 0.3mL），while the same volume of saline was injected into the cyst or caudal vein in control groups.Each group received injections twice a week for 4 weeks.At 48 h after the last injection，growth inhibition of the primary tumors in spleen and mean numbers ofmetastic tumors in liver were determined.Results Mixing CIKs and SW480 cells in the ratio of 60：1 inhibited SW480 proliferation by（75.3±8.42）%.CD3/CD56 were expressed on（36.4±13.2）%of CIK cells.Tumor inhibition was 32.07%in the animals injected in the cyst and 16.54%in the animals injected in the caudal vein（P<0.05）；mean numbers ofmetastic liver tumorswere 2.47±1.02 in the group injected in the cyst and 5.05±1.06 in the group injected in the caudal vein（P<0.01）.Conclusion Injecting DC-CIKs into nu-micemay significantly inhibit the growth of primary tumors in spleen and metastic tumors in liver，and the effects are greater when the cells are injected into the liver subcapsule than into the caudal vein.

Liver neoplasm；Splenic neoplasm；Cytokine-induced killer cell；Dendritic cell；Subcapsule；Nudemouse

R735.7，733.2

A

1674-5671（2015）04-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.03

徐兵。E-mail：xubing1228@163.com