16種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)研究

宋偉華，袁善奎，劉 瓊，陳紅英，郝身偉

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥檢定所，北京 100125）

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥已經(jīng)成為不可或缺的生產(chǎn)資料，但農(nóng)田施用的農(nóng)藥大部分落入土壤，從而對(duì)土壤生物產(chǎn)生影響[1]。蚯蚓作為陸地生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，是土壤動(dòng)物區(qū)系的代表種群，其生命活動(dòng)不僅能改善土壤結(jié)構(gòu)，使其有益于土壤的通氣、排水、保水，而且可以通過(guò)分解轉(zhuǎn)化土壤中的有機(jī)物來(lái)提高土壤肥力[2-3]，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有至關(guān)重要的作用。由于蚯蚓對(duì)土壤中的某些污染物比許多其他土壤動(dòng)物敏感，因此國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者將蚯蚓作為土壤污染狀況的重要指標(biāo)生物進(jìn)行研究[4]。但目前的研究仍以急性毒性為主，缺乏對(duì)污染物低劑量長(zhǎng)期暴露條件下對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)研究[5]。為了評(píng)估農(nóng)藥使用對(duì)蚯蚓的風(fēng)險(xiǎn)，在我國(guó)農(nóng)藥登記管理過(guò)程中，先后發(fā)布了化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的急性毒性和繁殖毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則[6]，以及農(nóng)藥對(duì)土壤生物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南[7]。

為了解常用農(nóng)藥品種對(duì)蚯蚓的毒性效應(yīng)情況，筆者選擇了16種農(nóng)藥，其中包括6種殺蟲劑、2種殺菌劑和8種除草劑，參照上述試驗(yàn)準(zhǔn)則，采用人工土壤法測(cè)定了這些藥劑對(duì)蚯蚓的急性毒性，重點(diǎn)觀察成蚓死亡數(shù)量和形態(tài)學(xué)變化。另外，選擇新煙堿類殺蟲劑噻蟲胺對(duì)蚯蚓進(jìn)行繁殖毒性試驗(yàn)，重點(diǎn)觀察該藥劑對(duì)蚓繭和后代子蚓數(shù)量的影響。這些研究旨在為科學(xué)合理使用農(nóng)藥、保護(hù)土壤生態(tài)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試生物

赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），北京綠環(huán)靖宇科貿(mào)有限公司。

1.1.2 供試農(nóng)藥

16種供試農(nóng)藥的基本信息見表1，均為原藥，使用時(shí)用丙酮溶解制備成一定濃度的母液，丙酮用量小于0.1 g/L。

表1 供試農(nóng)藥

1.1.3 儀器設(shè)備

試驗(yàn)容器為1 L標(biāo)本瓶，瓶口處用浸濕的紗布蓋住，在保證空氣交換和透光性的同時(shí)防止蚯蚓逃逸）；PRX-350B智能人工氣候箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

將新引入蚯蚓置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境下馴養(yǎng)7 d以上，以排除環(huán)境變化對(duì)蚯蚓的影響。選取2月齡至1年具環(huán)帶的成蚓，體重300～600 mg，試驗(yàn)前于人工土壤中清腸24 h。

1.2.1 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

蚯蚓急性毒性試驗(yàn)參照GB/T31270.15—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第15部分進(jìn)行。采用人工土壤法，設(shè)5～7個(gè)濃度組，并設(shè)空白對(duì)照組。每個(gè)濃度組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。將標(biāo)本瓶放置在人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為18～22℃，相對(duì)濕度保持在70%～90%，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為400 lx～800 lx。于試驗(yàn)第7天和第14天觀察并記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無(wú)反應(yīng)則為死亡），及時(shí)清除死蚯蚓。

1.2.2 蚯蚓繁殖毒性試驗(yàn)

蚯蚓慢性毒性試驗(yàn)參照NY/T 3091—2017《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則第15部分：蚯蚓繁殖試驗(yàn)》進(jìn)行。設(shè)8個(gè)正式試驗(yàn)濃度,并設(shè)空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組，溶劑對(duì)照為丙酮，與最高濃度所含溶劑的量相同。每個(gè)濃度組均設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。試驗(yàn)共歷時(shí)8周。試驗(yàn)第28天，對(duì)存活的成蚓進(jìn)行觀察、計(jì)數(shù)，并將其從土壤中移除。將含有蚓繭的土壤在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4周后，觀察并統(tǒng)計(jì)蚓繭和幼蚓的數(shù)量。試驗(yàn)期間，采用粉碎過(guò)的牛糞作為飼料。于試驗(yàn)第2天至試驗(yàn)第28天期間提供飼料，每個(gè)容器中投放5 g飼料，每7 d喂食一次。

2 數(shù)據(jù)處理及毒性評(píng)價(jià)

采用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)Probit回歸分析方法計(jì)算各農(nóng)藥品種對(duì)蚯蚓的7 d和14 d急性毒性半致死濃度（LC50）及其95%置信限。并依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中毒性等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各藥劑對(duì)蚯蚓的急性毒性等級(jí)進(jìn)行劃分。另外，對(duì)繁殖毒性試驗(yàn)結(jié)果，采用單因素方差分析進(jìn)行方差均一性檢驗(yàn)后，分別選用LSD檢驗(yàn)和Dunnett檢驗(yàn)確定暴露組與對(duì)照組之間在蚓繭數(shù)和幼蚓數(shù)的差異，以P＜0.05作為不同處理之間差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與討論

3.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

16種供試藥劑對(duì)蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可見，不同類型農(nóng)藥品種之間以及同一類型農(nóng)藥的不同品種之間對(duì)蚯蚓的急性毒性均存在較大差異。根據(jù)14 d急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，參照GB/T 31270.15—2014《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)，所有藥劑對(duì)蚯蚓的急性毒性都在中等毒性及以下，其中新煙堿類農(nóng)藥的吡蟲啉、呋蟲胺、噻蟲胺對(duì)蚯蚓急性毒性表現(xiàn)為中毒，其14 d-LC50值分別為3.02 mg/kg干土、3.32 mg/kg干土、8.04 mg/kg干土；其他13種藥劑，包括同為新煙堿類農(nóng)藥的噻蟲啉和噻蟲嗪對(duì)蚯蚓的急性毒性均較低，14 d-LC50值均大于10 mg/kg干土，但環(huán)丙唑醇、吡唑草胺、莎稗磷3 種藥劑對(duì)蚯蚓也具有一定的毒性，14 d-LC50值為10～100 mg/kg干土。另外，同一種農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的14 d-LC50值均小于7 d-LC50值，表明隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)蚯蚓的死亡率呈上升的趨勢(shì)，農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性作用加重。

表2 干土中16 種農(nóng)藥原藥對(duì)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

蚯蚓受不同類型農(nóng)藥處理后，中毒癥狀不同。蚯蚓接觸含有呋蟲胺、吡蟲啉等毒性較高農(nóng)藥的土壤后，首先由于部分農(nóng)藥存在氣味，蚯蚓會(huì)延遲進(jìn)入土壤的時(shí)間，在進(jìn)行至第14天時(shí)，調(diào)查發(fā)現(xiàn)死亡的蚓體出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，少部分存活的蚯蚓出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、蚓體變細(xì)等中毒癥狀。蚯蚓接觸含有磺酰脲類、硫代氨基甲酸酯類、二硝基苯胺類農(nóng)藥的土壤后，少數(shù)蚯蚓死亡，但死亡的蚓體無(wú)腐爛現(xiàn)象，存活的蚯蚓行動(dòng)遲緩，蚓體變細(xì)、變軟，韌性增加，環(huán)帶變小；接觸含三唑類、三唑硫酮類農(nóng)藥的土壤后，除了蚓體變軟死亡外，沒有其他明顯的中毒癥狀。

3.2 繁殖毒性試驗(yàn)結(jié)果

97%噻蟲胺原藥對(duì)蚯蚓蚓繭數(shù)的影響見表3。由表3可見，噻蟲胺對(duì)蚯蚓蚓繭數(shù)具有一定的影響作用，但與溶劑對(duì)照相比，前3個(gè)低濃度下噻蟲胺未對(duì)蚓繭數(shù)產(chǎn)生明顯的影響，隨著濃度的升高，蚓繭數(shù)逐漸減少。在0.790 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對(duì)蚯蚓的蚓繭數(shù)產(chǎn)生了顯著影響（P=0.010），在1.78 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對(duì)于蚯蚓的蚓繭數(shù)產(chǎn)生了極顯著影響（P=0.008）。而在急性毒性試驗(yàn)中，噻蟲胺對(duì)蚯蚓的14 d-LC50值為8.04 mg/kg干土，由此可見，與急性毒性相比，1/10倍14 d-LC50劑量下對(duì)蚯蚓的產(chǎn)卵量就會(huì)產(chǎn)生顯著影響，說(shuō)明蚯蚓繁殖能力對(duì)藥劑的影響更敏感。

表3 97%噻蟲胺原藥對(duì)蚯蚓蚓繭的影響

97%噻蟲胺原藥對(duì)蚯蚓幼蚓數(shù)的影響結(jié)果見表4。從表4可見，噻蟲胺對(duì)最終蚯蚓數(shù)量也具有明顯的影響，但與溶劑對(duì)照相比，前5個(gè)濃度下噻蟲胺沒有對(duì)幼蚓數(shù)量產(chǎn)生明顯的影響，隨著濃度的升高，幼蚓數(shù)量逐漸減少。在1.78 mg/kg干土劑量下噻蟲胺對(duì)于蚯蚓的幼蚓數(shù)量產(chǎn)生了極顯著影響（P=0.005）。與噻蟲胺對(duì)蚯蚓的急性毒性LC50值（8.04 mg/kg干土）相比，低劑量的噻蟲胺會(huì)顯著降低蚯蚓的孵化率，使蚯蚓的幼蚓數(shù)量顯著減少。

表4 97%噻蟲胺原藥對(duì)蚯蚓幼蚓數(shù)的影響結(jié)果

4 結(jié) 論

在實(shí)驗(yàn)室條件下大多數(shù)農(nóng)藥品種對(duì)蚯蚓表現(xiàn)為低毒及以下，僅新煙堿類農(nóng)藥部分品種對(duì)蚯蚓的急性毒性表現(xiàn)為中毒。新煙堿類殺蟲劑源于植物源農(nóng)藥煙堿，具有獨(dú)特的作用機(jī)制，不僅有高效、廣譜及良好的根部?jī)?nèi)吸性、觸殺和胃毒作用，而且對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低，已成為使用較為廣泛的殺蟲劑類型[6]。

噻蟲胺對(duì)蚯蚓的繁殖毒性研究表明，在0.790 mg/kg干土劑量下噻蟲胺即可對(duì)蚯蚓的蚓繭數(shù)產(chǎn)生顯著影響（P=0.010），在1.780 mg/kg干土劑量下噻蟲胺即可對(duì)蚯蚓的幼蚓數(shù)量產(chǎn)生極顯著影響（P=0.005），上述劑量遠(yuǎn)低于噻蟲胺對(duì)蚯蚓的急性毒性（14 d-LC50值8.04 mg/kg干土），由此可見，低劑量噻蟲胺長(zhǎng)期暴露可對(duì)蚯蚓的產(chǎn)卵量和孵化率產(chǎn)生影響，使蚓繭數(shù)和幼蚓數(shù)顯著減少。急性毒性是研究蚯蚓在大劑量農(nóng)藥作用下短時(shí)間內(nèi)的快速毒性反應(yīng)，主要目的是在短時(shí)間內(nèi)闡明該藥劑的急性毒性作用特點(diǎn)，它常常是生態(tài)毒理試驗(yàn)研究的第一步。有研究表明，農(nóng)藥會(huì)對(duì)蚯蚓的新陳代謝、繭的數(shù)量和孵化能力有所影響。通過(guò)檢測(cè)蚯蚓的繁殖毒性來(lái)評(píng)價(jià)農(nóng)藥毒性大小，可能會(huì)比其他環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)更為敏感[7]。但在我國(guó)現(xiàn)有的農(nóng)藥登記環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指南中[8]，只有當(dāng)蚯蚓的初級(jí)急性風(fēng)險(xiǎn)RQ大于1或者受試農(nóng)藥在土壤中有累積風(fēng)險(xiǎn)（DT50值大于180 d）時(shí)才需要提供農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的繁殖毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，客觀上會(huì)忽視某些藥劑的慢性毒性風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)檗r(nóng)藥在野外的實(shí)際暴露濃度一般都比較低，僅考慮急性暴露條件下農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng)，不能很好地反映實(shí)際生態(tài)系統(tǒng)中低劑量農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的長(zhǎng)期毒性效應(yīng)。因此，開展蚯蚓慢性毒性試驗(yàn)，通過(guò)將蚯蚓與低劑量農(nóng)藥長(zhǎng)期接觸，觀察農(nóng)藥在亞致死毒性劑量下長(zhǎng)期暴露對(duì)蚯蚓的成長(zhǎng)和繁殖等的變化，對(duì)于監(jiān)測(cè)預(yù)警環(huán)境污染物，保護(hù)土壤生物種群，以及維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有重要意義。