淺談痰標(biāo)本涂片培養(yǎng)

王偉

摘要：目的：了解感染患者的口腔痰液標(biāo)本原始涂片檢查方法及檢測結(jié)果的影響。方法：對30份痰液標(biāo)本檢查結(jié)果與細菌培養(yǎng)鑒定進行分析研究。結(jié)果：口痰液標(biāo)本30份以呈純培養(yǎng)或優(yōu)勢生長為陽性，涂片與培養(yǎng)結(jié)果符合率68.6%。結(jié)論：高質(zhì)量痰標(biāo)本涂片染色或濕片直接鏡檢，可取得最早期快速的初步病原學(xué)診斷，對一些特殊病原體如抗酸桿菌、放線菌、奴卡菌，一些真菌以及伊氏肺袍子菌、寄生蟲等引起的感染，可做出較明確的初步診斷。

關(guān)鍵詞：痰標(biāo)本涂片；痰液細菌培養(yǎng)

[中圖分類號]R441.5 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1672-8602（2015）02-0461-01

引起呼吸系統(tǒng)感染的病原譜非常廣，包括細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體、立克次體等微生物以及原蟲、吸蟲、絳蟲等寄生蟲。目前細菌和病毒仍是呼吸系統(tǒng)感染最常見的病原體。臨床常用的病原檢測方法包括痰涂片鏡檢、培養(yǎng)鑒定等。通過痰涂片、培養(yǎng)等檢查可明確呼吸道感染的病原體類型，通過病原體培養(yǎng)還可以進行藥物敏感試驗，指導(dǎo)臨床醫(yī)師合理用藥。30份痰液標(biāo)本進行涂片檢查并培養(yǎng)結(jié)果進行分析，提高痰培養(yǎng)準(zhǔn)備性。

1.材料與方法

1.1標(biāo)本來源 2014年5月-6月收治的門診及住院患者痰液標(biāo)本30份。

1.2采集 病人清晨起床后，用清水反復(fù)漱口后用力自氣管咳出第一口痰于滅菌容器內(nèi)，立即送檢驗。對于痰量少或無痰的病人，可采用3%～5%氯化鈉溶液5 mL霧化吸入約5 min進行導(dǎo)痰，使痰液易于排出。對咳痰量少的幼兒，可輕輕壓迫胸骨上部的氣管，使其咳嗽。采集后的痰，收集于滅菌容器中立即送檢，因為室溫下延擱2h會降低肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌的分離率。

1.3方法

1.3.1不染色涂片法 痰標(biāo)本直接涂片檢查病原體常用的有濕片法、懸滴法和毛細管法等，主要檢查病原體的動力和運動狀況。該法對檢查肺部寄生蟲感染具有獨特的診斷價值。該法的缺點是陽性率一般不高，需結(jié)合其他檢查方法以提高檢查的敏感性。

1.3.2染色涂片法 標(biāo)本經(jīng)涂片、干燥、染色后再檢查對鑒別甚至診斷病原體有重要的意義?？赏ㄟ^痰直接涂片光鏡檢查判斷是否為感染性痰液或痰液標(biāo)本受到口腔寄生菌的污染。若每低倍視野鱗狀上皮細胞<10個、白細胞>25個或鱗狀上皮細胞：白細胞<1：2.5，則表示痰液標(biāo)本較好，受到的污染較輕；低倍鏡下若痰液標(biāo)本每視野>25個鱗狀上皮細胞，則標(biāo)本受污染的可能性大。涂片染色方法較多，革蘭染色可將細菌分為革蘭陽性和革蘭陰性兩大類；通過抗酸染色可以發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；Gomori（GMS）六亞甲基四胺銀染色或亞甲胺藍染色（TBO）可顯示卡氏肺孢子蟲包囊等。經(jīng)過染色，可以觀察病原體形狀、大小、排列、染色特性以及有無莢膜、鞭毛、芽孢和異染顆粒等特殊結(jié)構(gòu)，有利于病原體的診斷和鑒別。在細菌培養(yǎng)和藥敏試驗尚未獲得結(jié)果的情況下，通過染色法檢查細菌有助于臨床醫(yī)生初步選用抗生素。

1.3.3細菌培養(yǎng)鑒定

1.3.3.1需氧培養(yǎng)法 將細菌接種于培養(yǎng)基，在大氣條件下，培養(yǎng)18～24小時。該方法需氧菌和兼性厭氧菌均可在培養(yǎng)基上生長。但一些生長緩慢的細菌如結(jié)核桿菌需培養(yǎng)3～7天甚至1個月才能生長。需要培養(yǎng)較長時間的細菌，接種后應(yīng)將試管塞好用石蠟凡士林封固，以防培養(yǎng)基干燥。

1.3.3.2二氧化碳培養(yǎng)法 將細菌接種于培養(yǎng)基上，再置于二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)的方法。如布氏桿菌需要在一定的二氧化碳環(huán)境中才能生長。

1.3.3.3厭氧菌培養(yǎng)法 將細菌接種于培養(yǎng)基上，再置于無氧環(huán)境中進行培養(yǎng)的方法：厭氧菌培養(yǎng)的標(biāo)本采集和送檢必須嚴(yán)格，一般來說，經(jīng)口腔咳出的痰液對厭氧菌培養(yǎng)無送檢價值。采集支氣管分泌物做厭氧菌培養(yǎng)，可通過以下方式：①經(jīng)環(huán)甲膜穿刺。②經(jīng)皮肺穿刺。③經(jīng)PBAL方式：標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢并及時處理。厭氧菌首先經(jīng)過初代培養(yǎng)，然后進行次代培養(yǎng)。其初步鑒定常常根據(jù)細菌形態(tài)、革蘭染色特性、菌落性狀、吲哚和接觸酶反應(yīng)等特征進行判定，而最后確診需要對培養(yǎng)細菌進行生化特性及終末產(chǎn)物等多項檢查。

2.結(jié)果

待細菌培養(yǎng)長出后，根據(jù)菌落計數(shù)和痰液標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，計算出每毫升痰液所含細菌濃度，通常以每毫升菌落形成的單位（CFU/mLl來表示，然后確定是否為致病菌及細菌的種類。口痰液標(biāo)本30份以呈純培養(yǎng)或優(yōu)勢生長為陽性，涂片與培養(yǎng)結(jié)果符合率68.6%。

3.討論

涂片光鏡檢查操作簡便，通過痰標(biāo)本涂片檢查可取得最早期的初步病原學(xué)診斷，對有些病原體如抗酸桿菌、放線菌、奴卡菌、真菌咖念珠菌、隱球菌、曲菌和毛霉菌1以及卡氏肺孢子蟲、寄生蟲等引起的感染做出較明確的診斷。細菌培養(yǎng)包括需氧菌培養(yǎng)、厭氧菌培養(yǎng)、結(jié)核菌培養(yǎng)以及真菌培養(yǎng)等。不同細菌培養(yǎng)條件各異，因此應(yīng)選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基、接種方法和培養(yǎng)方法。

痰標(biāo)本的消化與洗滌由于上呼吸道有正常菌群定植，因此在做痰培養(yǎng)前，標(biāo)本接種前的預(yù)處理尤為重要，基本要求應(yīng)該首先對痰標(biāo)本進行洗滌（痰標(biāo)本先加人10～20 mL無菌生理鹽水中洗滌3次），然后用乙酰半胱氨酸等蛋白水解酶等消化液進行消化，將均質(zhì)化后的標(biāo)本離心3 000 r/min離心10min，棄去上清液取沉淀物接種培養(yǎng)基。痰液消化過程有助于痰核內(nèi)部細菌的暴露，提高痰標(biāo)本培養(yǎng)的陽性檢出率，尤其是能顯著提高流感嗜血桿菌檢出率。微生物實驗室收到標(biāo)本后應(yīng)立即處理、接種。所用的培養(yǎng)基包括分離和鑒別革蘭陽性菌的血平板、革蘭陰性菌鑒別的平板如麥康凱平板，以及接種富含營養(yǎng)的巧克力平板以提高分離流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和腦膜炎奈瑟菌的陽性率并將其置于5%-10%的CO2、35-37℃的環(huán)境中孵育。

痰液化后進行系列稀釋，分別接種于培養(yǎng)皿。根據(jù)菌落計數(shù)和痰標(biāo)本稀釋倍數(shù)，計算出每毫升痰中各種細菌的含菌量。也可采用0.001 mL標(biāo)準(zhǔn)環(huán)接種液化處理的痰標(biāo)本。痰定量培養(yǎng)分離的致病菌或條件致病菌濃度≥107CFU/mL，可認(rèn)為是肺部感染的病原體；～

標(biāo)準(zhǔn)定量培養(yǎng)方法操作煩瑣，臨床實驗室推廣困難。為此，建議采用痰半定量方法，即用接種環(huán)將痰液在血平板、巧克力平板上按規(guī)定劃線要求做四區(qū)劃線接種標(biāo)本進行培養(yǎng)，每劃一區(qū)后均須加熱接種環(huán)，使細菌在平板上生長數(shù)逐級下降。目前，國際上較為認(rèn)同的半定量判斷標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)勢菌可定義為生長菌落為（+++），或（+++）以上。高質(zhì)量的標(biāo)本可以只鑒定和報告優(yōu)勢生長的需氧菌和兼性厭氧菌。只在原始區(qū)生長的少數(shù)菌不必做常規(guī)鑒定，除非臨床或直接革蘭染色提示可能為感染的病原菌。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)病人情況判斷各種細菌的臨床意義。