肉類食品中豬源性成分檢測(cè)方法之探討

王志忠 漆曉華

摘 要：文章介紹了幾種主流豬源性成分的檢測(cè)方法，同時(shí)對(duì)各種方法的基本原理、適用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了探討。希望對(duì)相關(guān)工作提供參考。

關(guān)鍵詞：豬源性；檢測(cè)方法；擴(kuò)增；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

食品安全問(wèn)題是一個(gè)永恒的話題，而清真食品安全也成為各穆斯林民族的關(guān)注點(diǎn)，其中肉類食品中豬源性成分的檢測(cè)已提到一個(gè)重要的地位上來(lái)。目前，在動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法中，最主要的是基于蛋白質(zhì)和基因的兩大類檢測(cè)方法，利用DNA的分子生物學(xué)方法開(kāi)發(fā)定性、定量檢測(cè)食品、飼料中動(dòng)物源性成分的方法和技術(shù)已逐漸成為該領(lǐng)域的研究主流，也成為多數(shù)國(guó)家檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中指定的檢測(cè)方法[1]。包括傳統(tǒng)擴(kuò)增（PCR）法，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2]就采用該法檢測(cè)飼料中的豬源性成分，而實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增（PCR）法和雙重?zé)晒鈹U(kuò)增法是在傳統(tǒng)實(shí)時(shí)PCR法基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，具有快速、高靈敏等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，亦有采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進(jìn)行檢測(cè)的研究，幾種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。下面，文章對(duì)常用的傳統(tǒng)PCR法、實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增（PCR）法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法進(jìn)行分析探討，供食品檢驗(yàn)人員借鑒。

1 傳統(tǒng)PCR法

傳統(tǒng)PCR法的基本原理，是對(duì)高溫下將雙鏈DNA變成單鏈的模板DNA的兩條鏈的一段互補(bǔ)序列，在適宜溫度下與兩條互不相補(bǔ)的寡核苷酸片段（引物）發(fā)生退火，利用DNA聚合酶催化延伸，如此反復(fù)擴(kuò)增。然后利用凝膠電泳染色檢測(cè)，與已知陽(yáng)性、已知陰性及空白組進(jìn)行對(duì)照，如果檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，再進(jìn)行內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，并將反應(yīng)結(jié)果再次進(jìn)行對(duì)照。酶切反應(yīng)亦為陽(yáng)性，則判定含有豬源性成分。

傳統(tǒng)PCR方法的靈敏性和特異性較高，目前是鑒別豬源性成分的主要選擇。但在檢測(cè)中局限性較大，由于假陽(yáng)性率高，最終定性需要進(jìn)行酶切反應(yīng)造成檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，而通過(guò)條帶亮度進(jìn)行定量準(zhǔn)確性相對(duì)較差，特別是在較大濃度它種動(dòng)物肉存在下會(huì)明顯影響其靈敏度，不適用于摻入豬源性成分的肉類食品的檢測(cè)。

2 實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增（PCR）法

實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增法是美國(guó)Applied Bio systems公司基于傳統(tǒng)PCR法于1996年所提出，原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，其中包括熒光染色和熒光探針兩種辦法（目前以熒光探針技術(shù)為主，其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)），利用每次擴(kuò)增循環(huán)的熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程中，熒光定量PCR儀對(duì)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化量進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，記錄其增加到某一閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的PCR循環(huán)次數(shù)即循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct值），最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[3]。由于在PCR擴(kuò)增時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在有線性關(guān)系，所以可以成為定量的依據(jù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，其擴(kuò)增程序與傳統(tǒng)PCR法基本一致，但采用了在擴(kuò)增過(guò)程中添加熒光劑的手段，并在每次擴(kuò)增循環(huán)后收集熒光做出擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定其結(jié)果。

實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增法的優(yōu)點(diǎn)是，縮短了檢測(cè)時(shí)間，克服了PCR固有的平臺(tái)效應(yīng)，從而可以較為準(zhǔn)確進(jìn)行定量，同時(shí)在較大濃度它種動(dòng)物肉存在下不會(huì)明顯影響其靈敏度。但熒光探針?lè)ù嬖谥贿m合特定目標(biāo)、本底較低的探針難以找到等問(wèn)題，特別是檢測(cè)成本昂貴，難以大范圍應(yīng)用。

3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法的原理是，在一定條件下提取的不同肉類肌漿蛋白會(huì)存在含量和種類差異，利用此差異，篩選出用離子強(qiáng)度為0M的純水提取肉中的肌漿蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳鑒別豬肉特有的條帶，從而區(qū)分豬肉和其它肉類。同理，該方法亦可區(qū)分鑒別其它肉類。

Orhan等人于2011年[4]利用肌漿蛋白亞基數(shù)和分子質(zhì)量存在差異區(qū)別了生活在不同流域的遠(yuǎn)東紅點(diǎn)鮭魚(yú)；Magdalena[5]、Hugo A[6]等也利用了肌漿蛋白的亞基條帶和分子量的差異對(duì)牛、馬、豬、羊等動(dòng)物物種進(jìn)行了區(qū)分。

該方法的優(yōu)點(diǎn)是，基于肌漿蛋白的差異性鑒定動(dòng)物源性成分，較基于DNA序列特異性的PCR法成本較低，對(duì)儀器和操作要求也比較低，但在靈敏度、準(zhǔn)確度和檢測(cè)限等方面不及PCR法，特別是無(wú)法對(duì)豬源性成分進(jìn)行定量，應(yīng)用受到限制。

4 結(jié)束語(yǔ)

從上文看出，PCR和實(shí)時(shí)PCR法是目前豬源性成分檢測(cè)的主流方法，其定性準(zhǔn)確，并可以對(duì)被檢成分進(jìn)行定量，但對(duì)儀器設(shè)備要求較高，擴(kuò)增耗時(shí)較長(zhǎng)，難以進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)成本較高，特別是實(shí)時(shí)PCR法的成本昂貴。SDS-PAGE法檢測(cè)成本較低，且耗時(shí)較少，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)，但靈敏度和準(zhǔn)確度方面需進(jìn)一步提高。

最后，需要說(shuō)明的是，以上方法鑒別豬源性成分僅限于含有生鮮肉的制品，對(duì)于加工煮熟的肉制品則難以鑒定，尚需研究更新更好的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]李家鵬，喬曉玲，等.食品和飼料中動(dòng)物源性成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：340-346.

[2]GB/T 21101-2007.動(dòng)物源性飼料中豬源性成分定性檢測(cè)方法[S].PCR方法.

[3]Heid CA，Stevens J，Livak K J，etal.Real time quantitative PCR [J].Genome Research，1996，6：986-994.

[4]Orhan Demir，Ali Günlü，F(xiàn)ahrettin Kücük，et al. Analysis of sarcoplasmic proteins in natural populations of mountain trout with SDS-PAGE[J].African Journal of Biotechnology，2011，10（55）：11758-11763.

[5]Magdalena Montowska，Edward Pospiech. Species identification of meat by electrophoretic methods[J].Acta Sci.Pol.，Technol.Aliment，2007，6（1）：5-16.

[6]Hugo A，Caldironi，Nicolas G. Quantitative determination of low-salt soluble protein patterns of bovine muscles cooked at different temperatures，by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis[J].Jourmal of Food Science，1980（45）：901-904.