狹葉薰衣草特征指紋圖譜研究

李晨陽(yáng)　譚為　陳燕　趙軍　徐芳

摘要：目的 建立20批狹葉薰衣草的指紋圖譜。方法 采用Phenomenex ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈和0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm。通過(guò)相似度評(píng)價(jià)和主成分聚類(lèi)分析對(duì)20批狹葉薰衣草進(jìn)行歸類(lèi)。結(jié)果 提取了10個(gè)色譜峰為狹葉薰衣草的指紋圖譜共有峰，指認(rèn)了2個(gè)色譜峰。20批狹葉薰衣草的相似度在0.9以上，通過(guò)主成分聚類(lèi)分析將20批狹葉薰衣草分為3類(lèi)。結(jié)論 該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，建立的狹葉薰衣草指紋圖譜可用于規(guī)范和控制狹葉薰衣草藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：狹葉薰衣草；高效液相色譜法；指紋圖譜；迷迭香酸；主成分聚類(lèi)分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.024

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）04-0087-05

Study on HPLC Characteristic Fingerprints of Lavandula Angustifolia LI Chen-yang， TAN Wei， CHEN Yan， ZHAO Jun， XU Fang （Xinjiang Institute of Materia Medica， Urumqi 830004， China）

Abstract：Objective To establish the fingerprints of 20 batches of Lavandula Angustifolia by HPLC. Methods The determination was performed on a Phenomenex ODS-A column （250 mm× 4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was in gradient elute mode with a mixture consisting of acetonitrile and 0.036 mol/L phosphate acid solution. The flow rate was 1.0 mL/min. The temperature was 30 °C. The determine wavelength was 350 nm. The fingerprints of 20 batches of Lavandula Angustifolia were compared and classified by similarity evaluation， cluster analysis， and principal composition analysis. Results Totally 10 chromatographic peaks were extracted as the common peaks of Lavandula Angustifolia， and 2 peaks were identified. The similarity degrees of the 20 batches of Lavandula Angustifolia were above 0.9. All the batches of Lavandula Angustifolia were classified into 3 categories. Conclusion The method is simple and reproducible， and can be used for the standardization and quality control of Lavandula Angustifolia.

Key words：Lavandula Angustifolia；HPLC；fingerprint；rosmarinic acid；principal composition cluster analysis

狹葉薰衣草Lavandula angustifolia Mil.為唇形科植物，20世紀(jì)初，我國(guó)從國(guó)外引種栽培成功，現(xiàn)已在新疆伊犁地區(qū)大面積推廣種植[1-3]。狹葉薰衣草作為新疆特有的芳香類(lèi)植物，無(wú)論在藥理活性還是臨床應(yīng)用上都有很高的價(jià)值[4-6]。為進(jìn)一步提高狹葉薰衣草藥材質(zhì)量的可控性，我們?cè)趯?duì)狹葉薰衣草中迷迭香酸含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，以迷迭香酸為對(duì)照建立狹葉薰衣草的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜[7]。本研究考察20個(gè)不同產(chǎn)地及批次的狹葉薰衣草，結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行分析，并建立狹葉薰衣草標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，通過(guò)

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳青年科技人才專(zhuān)項(xiàng)科研 項(xiàng)目（2013Y04）

通訊作者：徐芳，E-mail：xufangxj@163.com

相似度評(píng)價(jià)和主成分聚類(lèi)分析對(duì)20批不同產(chǎn)地的狹葉薰衣草藥材進(jìn)行分析歸類(lèi)，以提高狹葉薰衣草藥材質(zhì)量控制水平，促進(jìn)狹葉薰衣草的深入開(kāi)發(fā)。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外可見(jiàn)檢測(cè)器（日本島津有限公司）；梅特勒AL-204型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；AS10200AD型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

乙腈，色譜純，F(xiàn)isher公司；水，娃哈哈純凈水；磷酸等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)MUST-1202702，純度≥98%），成都曼斯特生物科技有限公司。木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)111720-201106），中國(guó)食品藥品檢定研究院。20批狹葉薰衣草藥材采自不同地區(qū)或從不同市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)（見(jiàn)表1），經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為狹葉薰衣草Lavandula angustifolia Mill.的干燥花。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex ODS-A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.036 mol/L磷酸二元梯度洗脫（0→20→50→55→60 min，乙腈10%→15%→22.5%→40%→10%）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取狹葉薰衣草藥材，粉碎（過(guò)40目篩），取約0.3 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇100 mL，超聲（功率280 W，頻率25 kHz）提取1 h，過(guò)濾，將濾液減壓濃縮后移至25 mL量瓶中，加甲醇定容，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取迷迭香酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.129 6 mg的迷迭香酸對(duì)照品溶液。取木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.081 6 mg的木犀草苷對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一份狹葉薰衣草藥材的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以迷迭香酸色譜峰為對(duì)照，比較各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算結(jié)果均RSD<1.0%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰相對(duì)峰面積均RSD<3%，表明本方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批狹葉薰衣草藥材6份，分別按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣，記錄色譜圖，以迷迭香酸色譜峰為對(duì)照，比較各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算結(jié)果均RSD<1.0%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰相對(duì)峰面積均RSD<3%，表明本方法的重復(fù)性符合要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份狹葉薰衣草藥材的供試品溶液，分別在0、1、5、7.5、24、32 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以迷迭香酸色譜峰為對(duì)照，比較各主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，相對(duì)保留時(shí)間計(jì)算結(jié)果均RSD<1.0%，占總峰面積百分比5%以上的共有峰相對(duì)峰面積均RSD<3%，表明供試品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定性符合測(cè)試要求。

2.5 狹葉薰衣草對(duì)照指紋圖譜的建立

采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A）》對(duì)20批不同產(chǎn)地及批次狹葉薰衣草的色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)10個(gè)共有色譜峰（見(jiàn)圖1），其中峰8為木犀草苷，峰10為迷迭香酸（見(jiàn)圖2）。共有特征峰占總峰面積的90%以上，20批次不同產(chǎn)地狹葉薰衣草相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.6 聚類(lèi)分析

以狹葉薰衣草藥材指紋圖譜中標(biāo)定的共有峰的相對(duì)峰面積為變量，運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用歐氏距離進(jìn)行聚類(lèi)分析[8]，結(jié)果見(jiàn)圖3。

根據(jù)藥材聚類(lèi)分析的結(jié)果將狹葉薰衣草藥材大致分為3類(lèi)。Ⅰ類(lèi)包括X17、X20、X12、X14、X18、X19、X3，多采收于2012年、2013年；Ⅱ類(lèi)包括X4、X6、X15、X16、X1、X11、X2、X5、X7、X8，采收于2010年、2011年；Ⅲ類(lèi)包括X9、X10、X13，采收于2011年。綜合聚類(lèi)分析提示其成分差異可能與藥材的采收及存放時(shí)間有關(guān)。

2.7 主成分分析

對(duì)20批狹葉薰衣草藥材樣品的10個(gè)共有峰采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)做標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)主成分的特征根>1，其貢獻(xiàn)率達(dá)79.598%，主成分分析結(jié)果見(jiàn)表3。

藥材主成分分析旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣見(jiàn)表4，每一個(gè)載荷量表示主成分與對(duì)應(yīng)變量的系數(shù)，經(jīng)計(jì)算可得主成分的模型。A1、A2、A3分別表示3個(gè)主成分，F(xiàn)1，F(xiàn)2……F10分別表示各個(gè)色譜峰的峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)。

由旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣可以看出，第1主成分主要反映了來(lái)自峰3、6、9、1、2的影響；第2主成分主要反映了來(lái)自峰10、5、7的影響，大多為迷迭香酸；第3主成分主要反映了來(lái)自峰8的影響，即木犀草苷；1～7、9均為未知峰，待進(jìn)一步確認(rèn)。

3 討論

本研究考察了以不同溶劑（30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和70%乙醇）為提取溶劑，采用超聲提取法，以狹葉薰衣草的峰面積和峰形為判斷依據(jù)，結(jié)果表明以70%甲醇提取效果最佳。在提取方法研究中，考察了加熱回流法和超聲提取法對(duì)指紋圖譜測(cè)定的影響，結(jié)果表明，2種提取方法的色譜圖大體一致，但超聲提取法操作更為簡(jiǎn)便快捷，故選擇超聲提取法。同時(shí)對(duì)提取時(shí)間（30、45、60 min）進(jìn)行考察，最終確定“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明，乙腈對(duì)狹葉薰衣草樣品中各成分的分離度和峰形更好，因此采用乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)。

狹葉薰衣草作為新疆維吾爾醫(yī)常用藥材，尚未見(jiàn)關(guān)于其指紋圖譜的研究，為加強(qiáng)對(duì)地產(chǎn)狹葉薰衣草的質(zhì)量控制，本研究采用HPLC測(cè)定了20批次新疆不同產(chǎn)地狹葉薰衣草藥材，提取了10個(gè)色譜峰為狹葉薰衣草的指紋圖譜共有峰，指認(rèn)了其中的2個(gè)色譜峰，樣品的相似度在0.9以上，說(shuō)明20批狹葉薰衣草的質(zhì)量較均一。指紋圖譜中的10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間符合程度好，相對(duì)面積略有差異，表明批次間各成分含量的相對(duì)比值有所不同，即使是同一產(chǎn)地，峰面積比值也有差別，這可能是受環(huán)境、水源和土壤等因素的影響。本試驗(yàn)采樣基數(shù)充足、范圍廣，涵蓋地產(chǎn)狹葉薰衣草多數(shù)產(chǎn)地。聚類(lèi)分析將20批狹葉薰衣草分為3類(lèi)，提示分類(lèi)可能與藥材的采收時(shí)間有關(guān)。主成分分析篩選出共有的特征成分，分析結(jié)果指出主要影響要素。2種分析方法結(jié)合使用，互相支撐，互相依托，彌補(bǔ)了相似度評(píng)價(jià)指紋圖譜的不足，也為狹葉薰衣草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及規(guī)范狹葉薰衣草藥材市場(chǎng)提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：112.

[2] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)：上冊(cè)[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993：394.

[3] 肖克來(lái)提，郭英芳.維藥薰衣草的國(guó)內(nèi)外應(yīng)用簡(jiǎn)介[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2006（4）：31-32.

[4] 趙軍，徐芳，譚為，等.狹葉薰衣草的化學(xué)成分[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2012， 29（1）：47-50.

[5] Louis M， Kowalski SD. Use of aromatherapy with hospice patients to decrease pain， anxiety， and depression and to promote an increased sense of well-being[J]. Am J Hosp Palliat Care，2002， 19（6）：381-386.

[6] 王玉芹，孫亞軍，施獻(xiàn)兒.薰衣草精油的化學(xué)成分與藥理活性[J].國(guó)外醫(yī)藥：植物藥分冊(cè)，2004，19（1）：5-8.

[7] 李晨陽(yáng)，趙軍，徐芳，等.狹葉薰衣草藥材中迷迭香酸的含量測(cè)定[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29（3）：230-232.

[8] 林培玲，曾建偉，丁春花，等.草珊瑚藥材HPLC特征指紋圖譜研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（6）：856-860.

（收稿日期：2014-10-09；編輯：陳靜）