子午流注納甲法對急性缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B蛋白的影響

商俊芳等

摘要：目的 觀察子午流注納甲法對急性缺血性腦卒中（AIS）模型大鼠血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、S100B蛋白含量的影響。方法 選用SPF級SD雄性大鼠，采用大腦中動脈線栓法建立模型，按隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術組、模型組、循經(jīng)組和納甲組，空白組、假手術組和模型組不作治療，循經(jīng)組予循經(jīng)辨證取穴針刺治療，納甲組予子午流注納甲法針刺治療，每日定時治療1次，觀察神經(jīng)功能及腦梗死體積情況，檢測血清NSE、S100B蛋白的含量。結果 與模型組比較，循經(jīng)組、納甲組神經(jīng)功能評分下降、梗死灶體積減小、梗死灶體積百分比降低（P<0.05，P<0.01），血清NSE、S100B蛋白含量降低（P<0.05，P<0.01），納甲組效果總體優(yōu)于循經(jīng)組。結論 子午流注納甲法通過降低AIS模型大鼠血清NSE、S100B蛋白含量達到神經(jīng)保護和治療作用。

關鍵詞：子午流注納甲法；急性缺血性腦卒中；S100B蛋白；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；大鼠

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）06-0054-04

急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke， AIS）發(fā)病率、病死率、致殘率較高。近年來，隨著飲食結構及行為方式的變化，加之社會人口老齡化進程加劇，AIS發(fā)病率逐年升高，選擇一種有效治療方案及時救治，是改善預后、提高患者生活質量的關鍵。筆者應用子午流注納甲法針刺治療AIS患者，療效較好[1]。腦缺血后神經(jīng)膠質細胞的壞死和血腦屏障的破壞使神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）和S100B蛋白從腦組織溢出到血管腔隙[2]，其血清中水平變化能夠反映腦損傷程度及疾病預后。因此，本研究觀察子午流注納甲法對AIS模型大鼠血清中NSE、S100B蛋白的影響，為臨床提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

健康成年SD雄性大鼠60只，3月齡，SPF級，體質量（200±20）g，甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（甘）2011-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)學院實驗中心SPF級實驗室，適應性喂養(yǎng)1周，術前8 h禁食。所有動物按體質量編號，按隨機數(shù)字表法分組，抽取12只為空白組，12只為假手術組，其余進行造模。符合納入標準的造模成功大鼠再分成模型組、循經(jīng)組、納甲組，每組12只。

1.2 針具與儀器

華佗牌25 mm×0.32 mm美容針灸針，蘇州針灸器械廠。BP-1215型Sartorius分析天平，北京多利斯天平有限公司；TLS-2000A型電子秤，常熟雙杰測試儀器廠；TCG-16B型臺式低速離心機，上海醫(yī)療器械（集團）有限公司手術器械廠；DW-86L828型超低溫冰箱，中國海爾公司；CMIAS-108型多媒體病理圖像分析儀，北京航空航天大學研制。氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC），化學純，北京福星化工廠；NSE、S100B蛋白試劑盒，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 造模

參考文獻[3]方法，大腦中動脈線栓法制備大鼠AIS模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠板上，剪除頸部毛發(fā)并消毒，在頸部正中縱行切長約2 cm的開口，鈍性分離皮下筋膜、肌肉，充分暴露右側頸總動脈（CCA）及分支頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA），游離右側CCA，分別在CCA近心端、ECA及CCA遠心端掛線備用，用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結扎CCA、ECA。在CCA上距分叉部4 mm處剪一小口，將備用栓線插入至ICA，扎緊CCA遠心端的線以固定栓線，松開動脈夾，直至遇到少許阻力為止，從CCA分叉部起插入深度約為18～19 mm，術畢檢查無活動性出血后，將線頭置于體內，縫合皮膚。整個手術過程中環(huán)境溫度（25.0±1.0）℃，保證大鼠生命體征穩(wěn)定。術后單籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。假手術組處理方法同上，但不插線栓，僅分離右側CCA、ICA及ECA。大鼠麻醉清醒后，進行神經(jīng)系統(tǒng)評分，1～3分為造模成功，用于實驗，0分及昏迷不醒者剔除并補充。

1.4 治療

大鼠清醒后當日開始治療，每日同一時間治療1次，直至處死動物為止?？瞻捉M、假手術組和模型組每日只進行相同抓取，同期同步飼養(yǎng)，不作任何治療。參照文獻[4-5]穴位定位或類比取穴。循經(jīng)組循經(jīng)辨證選取“百會”向后斜刺、“合谷”直刺、“三陰交”直刺。納甲組在循經(jīng)辨證取穴基礎上根據(jù)文獻記載徐氏子午流注納甲法[6]，依日按時開穴針刺治療，所開穴位為主穴先刺，循經(jīng)辨證取穴為配穴后刺。每次留針20 min，針刺深度依穴位而定，均采用平補平瀉法。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 一般情況及神經(jīng)功能 每日觀察所有大鼠的精神狀態(tài)、皮毛光澤及亮度、自主活動、肢體運動、攝食情況、體質量變化。采用改良Bederson[7]及Longa[3]的方法進行4分制行為功能評分。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：不能完全伸展左側（癱瘓側）前肢，提鼠尾離開地面30 cm，左前肢表現(xiàn)為腕屈曲、肘屈曲、肩內旋或兼而有之；2分：行走時，大鼠向左側（癱瘓側）轉圈；3分：行走時，大鼠身體向左側（癱瘓側）傾倒或輕推肩部時即向左側傾倒；4分：不能自行行走或意識喪失。

1.5.2 血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B蛋白含量測定 治療7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，股動脈采血5 mL，注入離心管中，待凝固后（30～40 min），3000 r/min離心10 min，分離血清，置于-20 ℃冰箱備測。NSE、S100B蛋白含量采用ELISA測定，按照試劑盒使用說明操作。

1.5.3 腦梗死體積測定 采血后大鼠迅速斷頭處死，打開顱骨取腦，用生理鹽水沖洗后，放入-20 ℃冰箱中冰凍至適當硬度（約15 min）。取速凍大鼠腦組織，在視交叉處從枕極到額極冠狀位切腦，其后間隔2 mm連續(xù)做6個冠狀切片，放入2%TTC液中，37 ℃水浴箱中避光孵育20 min（10 min翻面）染色，正常腦組織染為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)不染色（白色），濾除TTC液，置于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，腦片按腦的前后順序整齊排列保存。數(shù)碼照相機拍照后輸入計算機，采用圖像分析軟件進行分析，計算每個層面梗死灶面積，將梗死灶面積乘以層厚（2 mm），得出每個層面的梗死灶體積，各層面的梗死灶體積相加即得出整個腦組織的梗死灶體積，同時計算前腦總體積及腦梗死范圍占同側大腦百分比（%）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩組間比較采用t檢驗（方差不齊時用t檢驗），多組間比較采用方差分析及q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況及神經(jīng)功能評定

手術大鼠均于術后1 h內清醒，假手術組較早出現(xiàn)攝食活動。造模大鼠均于術后2～3 d內出現(xiàn)活動減少，一般情況較差，精神萎靡喜臥，閉目不喜睜眼，反應遲鈍，食欲減退，毛發(fā)枯燥無光澤，肌肉瘦削，體重減輕，3 d后自主活動增加，皮毛光澤及亮度漸好轉，精神狀態(tài)亦有明顯改善，體質量增加，納甲組整體狀況恢復較模型組和循經(jīng)組快?？瞻捉M及假手術組大鼠活動正常，無神經(jīng)功能缺損癥狀，神經(jīng)功能評分為0分。術后3 h，循經(jīng)組及納甲組神經(jīng)功能評分與模型組比較略下降，但差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。術后3 d，納甲組神經(jīng)功能評分與模型組比較明顯下降（P<0.05，P<0.01）。納甲組與循經(jīng)組神經(jīng)功能評分比較各時點差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結果見表1。

2.2 子午流注納甲法對大鼠梗死灶體積的影響

空白組及假手術組無梗死灶形成。造模大鼠梗死側大腦半球水腫明顯，體積明顯大于對側，經(jīng)TTC染色后，均在梗死側大腦皮層出現(xiàn)邊界清晰、范圍恒定的蒼白梗死灶，提示造模理想。循經(jīng)組及納甲組梗死灶體積均較模型組減小，納甲組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。循經(jīng)組及納甲組梗死灶體積百分比較模型組降低（P<0.05，P<0.01），2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；腦梗死體積百分比較模型組下降（P<0.05）。結果見表2。

2.3 子午流注納甲法對大鼠血清中神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S100B蛋白含量的影響

與空白組比較，造模大鼠血清中NSE、S100B蛋白含量明顯升高（P<0.01）；循經(jīng)組及納甲組血清中NSE、S100B蛋白含量較模型組降低（P<0.01），2組比較NSE含量差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結果見表3。

3 討論

AIS屬中醫(yī)“中風”范疇，多由于氣血逆亂，導致腦脈痹阻或血溢于腦，以昏仆、半身不遂、肢麻、舌蹇等為主要臨床表現(xiàn)。有研究表明，AIS發(fā)病存在著晝夜節(jié)律性差異，并認為導致晝夜發(fā)病時間有規(guī)律的原因，可用人體生物鐘及內環(huán)境變化來解釋[8]，其發(fā)病存在著24 h時間節(jié)律差異，上午6-12時發(fā)病率較高，其中6-10時為最高時間段，應用圓形分布法分析，其平均發(fā)病的高峰時點為8點21分。此時間段加上時差因素正為卯、辰、巳時，當大腸、胃、脾主時；最高時間段正當手足陽明經(jīng)主時；高峰時點正為辰時，足陽明胃經(jīng)主時[9]。子午流注針法是按照人體氣血虛衰的周期性，從而應對自然界變化，采取逐日按時開穴的針灸治療方法，突出強調了時間因素對針灸效應的影響，能夠起到調和氣血、補虛瀉實、平衡陰陽的作用。

目前大多數(shù)學者認為，缺血性腦損傷后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞受到損害，大量的胞漿蛋白質漏出細胞進入細胞間液，可溶性的物質通過細胞間液進入腦脊液，穿過破壞的血腦屏障進入血液循環(huán)?？梢栽O想，檢測血清中與腦損傷有關的生物學物質可用來監(jiān)測腦卒中的嚴重程度，了解患者的神經(jīng)功能恢復情況及治療效果，并且有可能判斷患者的預后。S100蛋白是腦的特異性蛋白，因其表達水平與各種原因引起的腦損傷有緊密聯(lián)系，已被作為評價腦損傷的一個指標。NSE是神經(jīng)元損傷最敏感的生化指標，能夠反映腦損傷的程度，被認為是神經(jīng)元損傷的標志酶，且為最靈敏的生化指標，其水平變化能夠反映神經(jīng)元損傷程度及疾病預后[10]。NSE在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚未明了，但一些實驗研究顯示，其具有神經(jīng)保護作用，而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中參與膜結構形成并參與所有能量依賴性細胞過程[11]。另外，NSE是維持神經(jīng)元細胞膜興奮性的必需成分，與應激反應調控有關，具有一定的神經(jīng)保護作用。檢測其在血清中的含量，對腦損傷的早期診斷、判斷嚴重程度及針刺的影響、預后評估具有一定價值。

本實驗結果表明，模型大鼠神經(jīng)功能缺損，梗死側大腦半球水腫明顯，體積明顯大于對側，經(jīng)TTC染色后，均在梗死側大腦皮層出現(xiàn)邊界清晰、范圍恒定的蒼白梗死灶，線栓法建立AIS模型的造模方法可靠恒定，與手術創(chuàng)傷無關。AIS模型大鼠經(jīng)針刺治療后，一般情況及神經(jīng)功能明顯恢復，梗死灶體積百分比顯著下降，腦梗死體積明顯縮小，同時降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，子午流注納甲法效果更加顯著，優(yōu)于循經(jīng)辨證治療。對AIS模型大鼠進行針刺治療，可加速腦側支循環(huán)的建立，增加腦血流量，改善腦的氧代謝，保護神經(jīng)元，減少腦神經(jīng)元的凋亡，促進神經(jīng)功能缺損的恢復，減輕缺血后的繼發(fā)損傷，降低血清中NSE、S100B蛋白的含量，維持了神經(jīng)元細胞膜興奮性，減少神經(jīng)元、膠質細胞等神經(jīng)系統(tǒng)細胞破壞，降低神經(jīng)炎性反應，起到神經(jīng)保護作用，修復被破壞的腦細胞及腦血管，促進損傷的中樞神經(jīng)細胞修復，重建損傷的血腦屏障，維護血腦屏障正常的通透性，縮小腦梗死體積，起到治療作用，這可能是針刺治療AIS患者療效的機制之一。子午流注納甲法更能順應AIS發(fā)病晝夜節(jié)律性差異與人類的生物鐘有關的特點，依“陽日陽時開陽經(jīng)之穴，陰日陰時開陰經(jīng)之穴”的原則，于每日辰時或巳時納甲法按時開穴針刺，因而更利于疾病的治療。

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（收稿日期：2014-08-02）

（修回日期：2014-08-26；編輯：華強）