不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS—PAGE分析

楊欣 王秋紅 王悅 郭慧 邢娜 匡海學(xué)

摘要：目的 采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)鑒別不同地區(qū)板藍(lán)根，為板藍(lán)根藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。方法 采用SDS-PAGE技術(shù)，建立黑龍江和河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白圖譜。結(jié)果 黑龍江板藍(lán)根蛋白約含13條亞基，主要為10.5 kD、23.0 kD、24.9 kD、44.1 kD 4種亞基，河北板藍(lán)根蛋白約含12條亞基，主要為55.6 kD、45.9 kD、34.3 kD、18.9 kD、12.4 kD、10.5 kD 6種亞基。結(jié)論 SDS-PAGE技術(shù)可以用于鑒別不同地區(qū)的板藍(lán)根。

關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；鑒別；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.024

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0086-03

Analysis on Isatidis Radix Protein in Different Areas by SDS-PAGE YANG Xin， WANG Qiu-hong， WANG Yue， GUO Hui， XING Na， KUANG Hai-xue （Key Laboratory of Basic and Appilication Research of Chinese Medicine， Ministry of Education；Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacodynamic Material Bases；Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract：Objective To identify Isatidis Radix in different areas by SDS-PAGE；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Radix. Methods By using SDS-PAGE technology， the protein profiles of Isatidis Radix in Heilongjiang and Hebei regions were established. Results Isatidis Radix protein in Heilongjiang contained about 13 protein subunits， and the major subunits were 10.5 kD， 23.0 kD， 24.9 kD， and 44.1 kD. Isatidis Radix protein in Hebei contained about 12 subunits， and the major subunits were 55.6 kD， 45.9 kD， 34.3 kD， 18.9 kD， 12.4 kD， and 10.5 kD. Conclusion SDS-PAGE technology can be used as one of the references to identify Isatidis Radix in different areas.

Key words：Isatidis Radix；identify；SDS-PAGE

《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，正品板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根[1]，主要功效為涼血消腫、清熱解毒，研究表明其有抗內(nèi)毒素的作用[2-3]。由于板藍(lán)根用途非常廣泛，產(chǎn)量與市場(chǎng)的供求矛盾使其鑒別和質(zhì)量受到高度關(guān)注。目前中藥成分研究主要集中在生物堿、多糖等方面，而對(duì)蛋白質(zhì)等大分子的研究較少。本試驗(yàn)對(duì)不同地區(qū)的板藍(lán)根蛋白質(zhì)分子進(jìn)行指紋圖譜研究，以提供不同地區(qū)板藍(lán)根藥材的更多信息，為其質(zhì)量控制及進(jìn)一步研究提供參考。

1 儀器與試藥

UV-1700紫外分光光度計(jì)，日本島津；電泳儀和電泳自動(dòng)成像儀，美國(guó)BIO-RAD生化科技有限公司；電

通訊作者：匡海學(xué)，E-mail：hxkuang56@163.com

子天平，上海人和科學(xué)儀器有限公司；MIKRO220R離心機(jī)，德國(guó)Hettich。

板藍(lán)根樣本采自黑龍江和河北地區(qū)，每個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集10個(gè)樣本，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，用硅膠干燥，室溫保存。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑，BIO-RAD生化科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 蛋白提取

采用植物蛋白提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW2033）進(jìn)行蛋白提取，所提蛋白可直接進(jìn)行蛋白電泳分析。①取0.1 g板藍(lán)根，用液氮研磨成細(xì)末，轉(zhuǎn)入離心管中。②取990 μL蛋白抽提試劑，在進(jìn)行蛋白抽提前2～3 min加入10 μL蛋白酶抑制劑。③加入配好的組織蛋白抽提試劑。④冰上孵育20～30 min。⑤10 000×g離心20 min。⑥收集上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 蛋白定量檢測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用二喹啉甲酸（bicin-choninic acid，BCA）蛋白定量法[4-5]。紫外分光光度儀開(kāi)機(jī)預(yù)熱20 min。取7只滅菌后的試管（編號(hào)1～7），按表1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白（BSA）和待測(cè)蛋白樣品各100 μL分別加入做好標(biāo)記的試管1～7中，每個(gè)樣本做3個(gè)平行反應(yīng)。向每個(gè)試管中各加入2 mL BCA工作液，充分混勻，室溫孵育2 h。將各管冷卻至室溫。用分光光度計(jì)在562 nm處測(cè)定樣品及BSA的吸光值，分別讀取1～7號(hào)管的光密度。以蛋白濃度（μg/μL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白含量。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

管號(hào) BSA（μg） 0.9%氯化鈉溶液（μg） 稀釋后BSA（μg/μL）

1 100 0 2

2 200 200 1

3 200 200 0.5

4 200 200 0.25

5 200 200 0.125

6 200 200 0.062 5

7 0 200 0

2.3 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白完整性

采用雙垂直板SDS-PAGE進(jìn)行分析[6-8]。分離膠濃度10%，濃縮膠濃度5%，凝膠厚度為1 mm，考馬斯亮藍(lán)快速染色（G250）方法進(jìn)行凝膠染色，染色后的凝膠用 BIO-RAD掃描儀進(jìn)行掃描，重復(fù)3次，并采用Image Lab 4.0.1軟件進(jìn)行圖像分析。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，減少不必要的誤差，將1～7號(hào)試管在562 nm比色測(cè)定3次，求平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 比色測(cè)定結(jié)果

管號(hào) 濃度（μg/μL） 吸光值

1 0 0

2 0.062 5 0.022 4

3 0.125 0 0.050 7

4 0.250 0 0.115 3

5 0.500 0 0.207 6

6 1.000 0 0.422 6

7 2.000 0 0.795 7

3.2 板藍(lán)根的蛋白含量

將10個(gè)隨機(jī)樣品提取的蛋白進(jìn)行混合，采用BCA蛋白定量方法測(cè)得河北和黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白含量分別為1.594、2.613 μg/μL。

3.3 蛋白的完整性分析

黑龍江和河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白亞基分布見(jiàn)圖1、圖2。染色后板藍(lán)根蛋白質(zhì)條帶清晰，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，條帶顏色越深說(shuō)明蛋白含量越高，顏色越淺說(shuō)明蛋白含量越低。從板藍(lán)根蛋白SDS-PAGE圖及其亞基分布譜圖可以看出，黑龍江板藍(lán)根所含亞基數(shù)約為13條，亞基的分子質(zhì)量范圍為10.5～174 kD，其中，黑龍江板藍(lán)根蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為174 kD，最小為10.5 kD，亞基7、9、10、13含量最高。河北板藍(lán)根所含亞基數(shù)約為12條，亞基分子質(zhì)量范圍為10.5～173.3 kD，其中，河北板藍(lán)根蛋白亞基的最大分子質(zhì)量為173.3 kD，最小的為10.5 kD，亞基5、6、7、10、11、12含量最高。蛋白泳道和條帶分析見(jiàn)表3～表6?？梢?jiàn)，不同地區(qū)板藍(lán)根蛋白SDS-PAGE分離效果良好，分辨率高、條帶清晰、數(shù)量較多，蛋白條帶具有多態(tài)性，2個(gè)地區(qū)的板藍(lán)根有相似條帶，也有特征條帶。

圖1 黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白電泳圖譜

圖2 河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白電泳圖譜

表3 黑龍江地區(qū)板藍(lán)根標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析

條帶編號(hào) 分子量（kD） 相對(duì)前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.023 22 022 364 21.6 16.6

2 130.0 0.113 3 491 504 3.4 2.6

3 95.0 0.158 4 935 421 4.8 3.7

4 70.0 0.227 5 134 009 5.0 3.9

5 62.0 0.302 5 500 298 5.4 4.1

6 51.0 0.373 5 208 178 5.1 3.9

7 42.0 0.446 6 001 257 5.9 4.5

8 29.0 0.531 6 305 169 6.2 4.7

9 22.0 0.715 7 693 074 7.5 5.8

10 14.0 0.892 5 876 570 5.8 4.4

11 10.5 0.983 29 813 191 29.2 22.5

表4 黑龍江地區(qū)板藍(lán)根蛋白泳道和條帶分析

條帶編號(hào) 分子量（kD） 相對(duì)前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 174.0 0.025 24 160 535 24.7 18.1

2 131.0 0.113 137 551 0.1 0.1

3 76.9 0.206 231 887 0.2 0.2

4 66.5 0.259 230 681 0.2 0.2

5 63.7 0.285 334 263 0.3 0.3

6 56.1 0.338 1 037 026 1.1 0.8

7 44.1 0.428 8 150 014 8.3 6.1

8 27.2 0.574 667 722 0.7 0.5

9 24.9 0.632 3 694 112 3.8 2.8

10 23.0 0.687 4 029 782 4.1 3.0

11 15.2 0.859 1 505 624 1.5 1.1

12 13.9 0.894 370 510 0.4 0.3

13 10.5 0.978 53 374 947 54.5 40.0

表5 河北地區(qū)板藍(lán)根標(biāo)準(zhǔn)蛋白泳道和條帶分析

條帶編號(hào) 分子量（kD） 相對(duì)前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 175.0 0.018 4 219 390 4.4 4.0

2 130.0 0.108 4 061 943 4.2 3.9

3 95.0 0.157 5 697 243 5.9 5.4

4 70.0 0.226 6 982 415 7.3 6.6

5 62.0 0.303 7 892 021 8.2 7.5

6 51.0 0.372 6 400 264 6.7 6.1

7 42.0 0.447 7 513 453 7.8 7.2

8 29.0 0.530 7 327 250 7.6 7.0

9 22.0 0.718 8 925 736 9.3 8.5

10 14.0 0.892 8 137 079 8.5 7.7

11 10.5 0.979 28 744 703 30.0 27.4

表6 河北地區(qū)板藍(lán)根蛋白泳道和條帶分析

條帶編號(hào) 分子量（kD） 相對(duì)前沿 體積（lnt） 條帶百分比（%） 泳道百分比（%）

1 173.3 0.021 5 739 360 9.4 7.1

2 79.5 0.198 164 560 0.3 0.2

3 66.1 0.262 3 169 520 5.2 3.9

4 62.6 0.296 906 960 1.5 1.1

5 55.6 0.341 2 963 200 4.8 3.7

6 45.9 0.413 2 965 200 4.4 3.3

7 34.3 0.493 2 194 080 3.6 2.7

8 26.2 0.599 1 259 760 2.1 1.6

9 23.6 0.671 710 640 1.2 0.9

10 18.9 0.777 3 338 640 5.4 4.1

11 12.4 0.930 8 210 160 13.4 10.1

12 10.5 0.990 29 965 520 48.9 37.0

4 小結(jié)

本研究采用雙垂直板SDS-PAGE技術(shù)對(duì)不同地區(qū)板藍(lán)根進(jìn)行研究和分析，該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠、重現(xiàn)性好、樣品量少、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)可以通過(guò)比較蛋白圖譜，根據(jù)蛋白圖譜上的蛋白條帶數(shù)量、分子量大小、條帶顏色深淺等對(duì)不同地區(qū)、不同品種的藥材進(jìn)行鑒別和質(zhì)量研究。黑龍江地區(qū)板藍(lán)根是移栽品種，不同地域土壤酸堿度對(duì)植物種植和生長(zhǎng)及土壤肥力都有一定影響。本試驗(yàn)為板藍(lán)根藥材種植、質(zhì)量評(píng)價(jià)，以及進(jìn)一步深入研究提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2014-11-05）

（修回日期：2014-12-26；編輯：陳靜）