四神丸和葛根芩連片對結(jié)腸炎小鼠炎性細胞因子的影響

王旭丹 葛東宇 邱澤計 吳瑩 李根茂 郝鈺

摘要：目的 探討四神丸和葛根芩連片對硫酸葡聚糖鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性結(jié)腸炎細胞因子的影響。方法 小鼠自由飲用4%DSS連續(xù)5 d，制備急性結(jié)腸炎模型；小鼠4次循環(huán)飲用3%DSS制備慢性結(jié)腸炎模型。急性或慢性結(jié)腸炎實驗小鼠均隨機分為對照組、DSS急性或慢性模型組（模型組）、四神丸組、葛根芩連片組。急性模型小鼠于DSS飲水次日開始給藥，連續(xù)8 d；慢性模型于DSS飲水2次循環(huán)后開始給藥，連續(xù)16 d。ELISA檢測各組小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中γ-干擾素（IFN-γ）、IL（白細胞介素）-17A及IL-22的含量。結(jié)果 急性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17A及IL-22含量均明顯增加（P<0.01），葛根芩連片能顯著降低急性結(jié)腸模型小鼠IFN-γ、IL-17A的含量（P<0.05），四神丸則能顯著降低IL-17A的含量（P<0.05）。慢性結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17A較對照組顯著升高（P<0.01）；葛根芩連片及四神丸有降低二者的趨勢。與對照組比較，四神丸可升高IL-22含量（P<0.05）。結(jié)論 葛根芩連片和四神丸通過降低急性結(jié)腸炎模型小鼠IFN-γ、IL-17A含量達到其治療作用，四神丸通過促進IL-22升高發(fā)揮其治療慢性結(jié)腸炎的作用。

關(guān)鍵詞：四神丸；葛根芩連片；結(jié)腸炎；γ-干擾素；白細胞介素-17A；白細胞介素-22；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.020

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0071-04

Effects of Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet on Inflammatory Cytokines in Mice with Colitis WANG Xu-dan， GE Dong-yu， QIU Ze-ji， WU Ying， LI Gen-mao， HAO Yu （School of Basic Medical Science， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract：Objective To explore the effects of Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet on cytokines of acute and chronic colitis induced by dextran sulfate sodium （DSS） in mice. Methods Mice freely drank 4% DSS dissolved in drinking water for continuous 5 days to establish acute colitis model. Mice circularly drank 3% DSS for 4 times for the establishment of chronic colitis model. In the acute or chronic colitis experiment， mice were randomly divided into control group， acute and chronic model groups， Sishen Pill group， and Gegen Qinlian Tablet group. Acute model group was administrated one day after DSS drinking for 8 days. Chronic model group was administrated after the second time of circular drinking for 16 days. ELISA was used to detect the contents of IFN-γ， IL-17 and IL-22 in cultural supernatant of mouse colon. Results Contents of IFN-γ， IL-17A and IL-22 in cultural supernatant increased significantly in acute models （P<0.01）. Gegen Qinlian Tablet can significantly decrease the contents of IFN-γ and IL-17A of acute models （P<0.05）. Sishen Pill can significantly decrease the content of IL-17A （P<0.05）. IFN-γ and IL-17A in cultural supernatant in chronic model mice significantly increased compared with control group （P<0.01）. Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet inhibited the contents of IFN-γ and IL-17A. Compared with control group， Sishen Pill significantly increased the content of IL-22 （P<0.05）. Conclusion Sishen Pill and Gegen Qinlian Tablet can treat colitis by decreasing the contents of IFN-γ and IL-17A in acute colitis model mice；Sishen Pill can treat chronic colitis by promoting IL-22 to increase.

Key words：Sishen Pill；Gegen Qinlian Tablet；colitis；IFN-γ；IL-17A；IL-22；mice

基金項目：北京中醫(yī)藥大學(xué)科研基金（2013-JYBZZ-JS-119）

通訊作者：郝鈺，E-mail：yuhao64@sina.com

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種常見的慢性胃腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅氏?。–rohns disease，CD）。本病以腸道炎癥和黏膜組織損傷為特征，與腸道黏膜免疫反應(yīng)異常有著密切的關(guān)系[1]。Th1細胞是導(dǎo)致腸黏膜炎癥的主要效應(yīng)細胞，此后發(fā)現(xiàn)Th17在黏膜炎癥中也具有關(guān)鍵性作用[2]。硫酸葡聚糖鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎是研究IBD常用的動物模型。IBD的中醫(yī)辨證可分為多種證型，有報道認為，結(jié)腸炎早期多為大腸濕熱證，而后期多表現(xiàn)為脾腎陽虛證[3]，大腸濕熱證可用葛根芩連湯加減，脾腎陽虛證則可方用四神丸加味。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，四神丸及葛根芩連片均對DSS誘導(dǎo)的小鼠急性結(jié)腸炎有顯著的療效，四神丸對DSS誘導(dǎo)的慢性結(jié)腸炎也有明顯的療效（待發(fā)表）。本研究觀察四神丸及葛根芩連片對DSS誘導(dǎo)的急性及慢性結(jié)腸炎Th1分泌的γ-干擾素（IFN-γ）和Th17細胞分泌的IL（白細胞介素）-17A、IL-22的影響。

1 實驗材料

1.1 動物

雌性C57BL/6J小鼠80只，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0007。

1.2 藥物

四神丸購于北京同仁堂天然藥物有限公司，批號13080010；葛根芩連片購于太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號12120007。

1.3 主要試劑與儀器

DSS（分子量6500～10 000），Sigma-Aldrich，批號SLBB4215V；ConA，Sigma公司，批號71K7024；IL-17A和IL-22細胞因子ELISA試劑盒，Cusabio，批號S11033737、S24033738；IFN-γ細胞因子ELISA試劑盒，R&D，批號201309。5417R型高速冷凍離心機， Eppendof centrifuge；Calaxy S型CO2培養(yǎng)箱， RSBiotech公司；DNM型酶標儀，北京普朗新技術(shù)有限公司。

2 實驗方法

2.1 造模

參考文獻[4]方法，采用DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎模型。將DSS用蒸餾水配制成4%的溶液，令小鼠自由飲用，連續(xù)5 d。參考文獻[5]方法，采用DSS誘導(dǎo)慢性結(jié)腸炎模型。將DSS用蒸餾水配制成3%的溶液，令小鼠自由飲用，時間為1-5 d、8-12 d、15-19 d、22-26 d，循環(huán)4次，2次循環(huán)之間予常水飲用。

2.2 分組與給藥

實驗小鼠隨機分為對照組、模型組、四神丸組（2.25 g/kg，相當于臨床人用量的10倍）、葛根芩連片組（6.5 g/kg，相當于臨床人用量的10倍），每組10只。急性結(jié)腸炎實驗：給予DSS后次日開始給藥，每日次，連續(xù)8 d，第10日處死小鼠進行指標測定。慢性結(jié)腸炎實驗：DSS飲水2次循環(huán)后開始給藥（即實驗開始后第12日），每日1次，連續(xù)16 d，給藥后第17日（即實驗開始后第29日）處死小鼠進行指標測定。

2.3 結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液中細胞因子測定

結(jié)腸組織培養(yǎng)參考文獻[6]。超凈臺內(nèi)無菌取小鼠結(jié)腸，將結(jié)腸沿腸系膜縱向剖開，冷PBS溶液反復(fù)沖洗腸內(nèi)容物。各組任取8只動物相同位置的結(jié)腸一段，約1 cm長，置24孔板中，加入1 mL完全RPMI 1640溶液（含青霉素、鏈霉素、1 μg/mL兩性霉素B），置細胞培養(yǎng)箱中，37 ℃、5%CO2孵育24 h，高速離心后收集培養(yǎng)上清液。按ELISA試劑盒說明書測定結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液中每毫克蛋白中IFN-γ、IL-17A和IL-22的含量。

2.4 腸系膜淋巴結(jié)細胞分泌的細胞因子測定

小鼠脫頸處死后，無菌取腸系膜淋巴結(jié)（MLN），分離成單個細胞懸液，用完全RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×106/mL，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每孔再加入ConA（濃度為10 μg/mL，T細胞的絲裂原）100 μL。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，收集培養(yǎng)上清液。按ELISA試劑盒說明書測定結(jié)腸器官培養(yǎng)液中IFN-γ、IL-17A和IL-22的含量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以 —x±s表示，組間比較采用方差分析，方差齊時，各組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時，采用Tamhance's T2檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 模型小鼠和正常小鼠結(jié)腸組織和腸系膜淋巴結(jié)炎性細胞因子變化比較

通過檢測結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液和MLN中T細胞分泌的細胞因子變化發(fā)現(xiàn)：急性模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ較正常小鼠升高8.1倍，而MLN細胞培養(yǎng)上清液僅升高1.4倍，表明結(jié)腸中產(chǎn)生IFN-γ的Th1細胞比MLN中更為豐富；急性模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IL-17A和IL-22分別較正常小鼠升高4.1倍和8.6倍，而MLN細胞培養(yǎng)上清液均只升高1.6倍，表明結(jié)腸中的Th17較MLN中豐富。結(jié)果見圖1。DSS慢性結(jié)腸炎中，模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ為對照組的7.3倍，MLN則為對照組的2.4倍；結(jié)腸組織和MLN細胞培養(yǎng)上清液中IL-17A和IL-22變化差異較小；二者在結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液中均升高1.8倍，在MLN細胞培養(yǎng)上清液中則升高1.5倍和1.9倍。

結(jié)腸組織

MLN

圖1 模型組與對照組結(jié)腸組織與MLN細胞培養(yǎng)上清液中

炎性細胞因子比較

4.2 四神丸和葛根芩連片對急性結(jié)腸炎小鼠炎性細胞因子的影響

急性模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17A及IL-22含量均明顯增加（P<0.01），經(jīng)四神丸和葛根芩連片治療后，IFN-γ含量有所下降，葛根芩連片的降低作用更加明顯，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)腸培養(yǎng)上清液中的IL-17A含量均顯著下降（P<0.05）；但對IL-22含量均無明顯變化。結(jié)果見表1。

表1 各組急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液中

炎性細胞因子水平比較（—x±s，pg/mg）

組別 只數(shù) IFN-γ IL-17A IL-22

對照組 8 7.1± 4.2 29.8±11.1 174.4± 70.5

模型組 8 57.5±25.9** 123.7±52.4** 1496.8±657.4**

四神丸組 8 33.3±16.3* 59.7±39.9△ 1640.3±705.9**

葛根芩連片組 8 21.9± 9.9*△ 66.1±40.7△ 1211.3±737.2*

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

4.3 四神丸和葛根芩連片對慢性結(jié)腸炎小鼠炎性細胞因子的影響

慢性模型小鼠結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-17A含量明顯增加（P<0.01）。四神丸及葛根芩連片對慢性模型結(jié)腸上清液中IFN-γ有一定的降低趨勢，與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；二藥對IL-17A影響也不明顯，可能與IL-17A在結(jié)腸模型動物中升高并不明顯有關(guān)。慢性模型組IL-22含量較對照組略有升高，葛根芩連片對IL-22無明顯影響，但四神丸則使IL-22含量升高（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組慢性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液中

炎性細胞因子水平比較（—x±s，pg/mg）

組別 只數(shù) IFN-γ IL-17A IL-22

對照組 8 9.8± 5.0 16.1± 5.0 151.3± 79.7

模型組 8 71.3±23.6** 28.6±11.6** 270.6±140.4

四神丸組 8 44.9±19.9* 21.1± 3.4 334.5±134.0*

葛根芩連片組 8 53.2±16.9** 23.3± 8.6 254.7±142.5

5 討論

IBD是一種常見的慢性胃腸道疾病，是發(fā)生大腸直腸癌的主要風(fēng)險因子。本病臨床辨證可分為多種證型，大腸濕熱證和脾腎陽虛證是其中較為常見的2種證型[7]，以葛根芩連湯和四神丸為基礎(chǔ)方的方劑分別用于這兩型IBD的治療。有研究顯示，四神丸及葛根芩連湯對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的療效[8-9]。

DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎是研究IBD常用模型之一，DSS可直接破壞結(jié)腸黏膜上皮并激發(fā)炎癥[10]。研究顯示，DSS模型小鼠黏膜組織中存在Th1細胞，Th1分泌IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細胞活化并釋放炎癥因子，介導(dǎo)組織損傷。近年來發(fā)現(xiàn)，IBD患者及結(jié)腸炎模型動物的黏膜中還大量浸潤另一T細胞亞群，即Th17[11]。Th17分泌多種細胞因子，包括IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22[12]。Th17在腸黏膜炎癥中具有重要作用，正常生理狀態(tài)下，腸黏膜即富含Th17細胞并分泌相關(guān)細胞因子，對維持腸黏膜穩(wěn)定與控制共生微生物的適度免疫反應(yīng)之間的平衡至關(guān)重要。IL-17A的主要作用是介導(dǎo)炎癥、清除相關(guān)抗原，適度的IL-17A有免疫保護作用，如過量則介導(dǎo)免疫損傷。IL-22在腸黏膜炎癥中具有保護作用，補充IL-22可促進DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的恢復(fù)，敲除IL-22基因可使小鼠對結(jié)腸炎易感[13]。因此，本實驗中選擇了以上3種細胞因子進行檢測。

在選材上，我們比較了結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液和MLN細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的變化情況，結(jié)果顯示，2種取材部位的細胞因子變化趨勢上基本一致。在急性模型結(jié)腸培養(yǎng)上清液中細胞因子的變化幅度更為明顯。這一趨勢表明，制備模型后腸黏膜組織中分泌細胞因子的效應(yīng)細胞Th1及Th17更為豐富，而MLN中所增加的Th1和Th17數(shù)量較少。這一現(xiàn)象符合腸黏膜免疫反應(yīng)的基本原理，即部分抗原提呈細胞捕獲抗原后，引流到MLN，活化相應(yīng)的T細胞；活化產(chǎn)生的效應(yīng)T細胞（Th1和Th17）并不滯留在MLN，而是通過循環(huán)歸巢到腸黏膜固有層，參與免疫應(yīng)答。因此，富含效應(yīng)T細胞的組織是腸黏膜（尤其是黏膜固有層）而不是MLN。因此，選擇結(jié)腸組織培養(yǎng)上清液分析細胞因子的變化與T細胞介導(dǎo)的黏膜炎癥反應(yīng)的本質(zhì)更為契合。

本研究結(jié)果顯示，DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中IFN-γ、IL-17A和IL-22含量均顯著升高，表明急性炎癥黏膜組織中富含大量的Th1和Th17細胞。葛根芩連片能降低結(jié)腸培養(yǎng)上清液中IFN-γ，四神丸雖有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，葛根芩連片可通過抑制IFN-γ生成改善Th1介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。四神丸和葛根芩連片均能顯著降低IL-17A的含量，二方之間則無明顯的差異，表明二者可通過抑制IL-17A生成緩解Th17介導(dǎo)的炎癥。此外，四神丸和葛根芩連片對Th17分泌的IL-22的影響與IL-17A并不一致。即葛根芩連片可使IL-22含量略有降低，而四神丸則能使IL-22含量略有升高，但與模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。導(dǎo)致這種差異的原因可能是四神丸對Th17產(chǎn)生IL-17A或IL-22有不同的影響，也有可能四神丸促進其他相關(guān)細胞分泌IL-22。

慢性結(jié)腸炎模型IFN-γ較對照組顯著增加，且高于急性模型，表明Th1在慢性炎癥形成過程中有累積效應(yīng)。四神丸和葛根芩連片對IFN-γ有降低作用，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。慢性結(jié)腸炎模型動物IL-17A雖然顯著高于對照組，但較急性結(jié)腸炎已明顯降低；四神丸和葛根芩連片在慢性模型中對IL-17A的影響不大，可能與慢性模型中IL-17A升高并不顯著有關(guān)。慢性結(jié)腸炎模型小鼠IL-22高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)四神丸治療后，能進一步升高IL-22含量，葛根芩連片則無此作用。

綜上所述，葛根芩連片和四神丸能顯著抑制急性DSS結(jié)腸炎IFN-γ和IL-17A的生成，但對慢性結(jié)腸炎的IFN-γ和IL-17A無明顯作用。此外，四神丸對急性及慢性結(jié)腸炎中IL-22的生成均有一定的促進作用。葛根芩連片和四神丸對急性結(jié)腸炎的治療效應(yīng)與其抑制炎性細胞因子IFN-γ和IL-17A有關(guān)；四神丸對慢性結(jié)腸炎的有效作用可能與其在一定程度上促進IL-22合成有關(guān)。是否存在其他效應(yīng)尚需進一步研究。

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（收稿日期：2014-11-20）

（修回日期：2014-12-09；編輯：華強）