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    雷公藤紅素對HepG2細胞遷移的影響

    2015-05-30 14:45:35杜娜付建華李健劉福生張寅劉婷蘇澤琦丁霞
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2015年7期
    關(guān)鍵詞:時間濃度

    杜娜 付建華 李健 劉福生 張寅 劉婷 蘇澤琦 丁霞

    摘要:目的 探索雷公藤紅素對HepG2細胞遷移較佳抑制作用濃度及時間。方法 將HepG2細胞鋪于6孔板并培養(yǎng),待貼壁細胞密度達到70%~80%后,采用劃痕法制造細胞遷移模型,分為二甲基亞砜組及雷公藤紅素5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L組,于0、6、12、24 h觀察細胞形態(tài)及細胞遷移情況,拍照記錄,計算細胞遷移速度及細胞遷移抑制率。結(jié)果 雷公藤紅素對HepG2細胞遷移具有抑制作用,且其對細胞遷移抑制作用在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,濃度越高其抑制細胞遷移的作用越明顯。同一濃度不同作用時間高濃度雷公藤對HepG2細胞遷移的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);同一時間不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞遷移的抑制作用差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);雷公藤紅素高濃度組可使細胞形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)論 高濃度雷公藤紅素能使HepG2細胞形態(tài)發(fā)生改變并凋亡;雷公藤紅素抑制了HepG2細胞遷移,且該抑制作用與濃度、時間相關(guān),終濃度為5 μmol/L作用于HepG2細胞6 h時,其對HepG2細胞遷移抑制作用最明顯。

    關(guān)鍵詞:雷公藤紅素;細胞遷移;HepG2細胞;濃度;時間

    DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.015

    中圖分類號:R285.5 文獻標識碼:A 文章編號:1005-5304(2015)07-0051-04

    Effects of Celastrol on HepG2 Cells Migration DU Na1, FU Jian-hua2, LI Jian3, LIU Fu-sheng1, ZHANG Yin1, LIU Ting1, SU Ze-qi1, DING Xia3 (1.Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China;2.Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China;3.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

    Abstract:Objectives To explore a better inhibitory effect of concentration and time of Celastrol on migration of HepG2 cells. Methods HepG2 cells were planted and cultured in 6-well plates. When the adherent cell density reached 70%-80%, cell migration was manufactured by scratch experiment model. Then, cell morphology and cell migration were observed under microscope with different concentrations of Celastrol 5, 1, 0.5, 0.1, 0.01 μmol/L and DMSO at 0, 6, 12, 24 h. They were pictured and rates of cell migration and inhibition ratios of all groups were calculated. Results Celastrol inhibited HepG2 cell migration, and its inhibitory effect on the migration velocity was concentration-dependent in a certain range. The higher the concentration of Celastrol, the stronger effect is. Celastrol of the same concentration at different times had different inhibitory effect on cell migrationof HepG2 cells (P<0.05). Celastrol of different concentrations at the same time had different inhibitory effects on cell migration of HepG2 cells (P<0.05);Celastrol of high concentration cause dsevere changes in the cell morphology. Conclusion Celastrol of high concentration causes changes in the cell morphology and cell apoptosis of HepG2 cells. Celastrol inhibits HepG2 cell migration, which is dependent on the concentration and action time. The inhibitory effect of Celastrol on HepG2 cell migration is most obvious under final concentration of 5 μmol/L at 6 h.

    Key words:Celastrol;cell migration;HepG2 cell;concentration;time

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(91129714、81270466);教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20120013110014);

    國際科技合作專項(2009DFA31010)

    通訊作者:丁霞,E-mail:dingx@bucm.edu.com

    惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤發(fā)生和演進過程中的重要問題,腫瘤的轉(zhuǎn)移對于腫瘤治療來說是一大難題。因此,能否控制腫瘤轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后的重要因素之一。細胞遷移參與組織形成、胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)、傷口愈合、動脈粥樣硬化等多種生理、病理過程,且貫穿于腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程,是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟[1]。因此,抑制細胞遷移能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。雷公藤紅素是從雷公藤中提取的有效成分之一,其抗腫瘤作用受到廣泛關(guān)注。研究表明,其能夠抑制PMA誘導(dǎo)的乳腺癌細胞侵襲和遷移[2]。本實驗觀察雷公藤紅素對人肝癌HepG2細胞形態(tài)及細胞遷移的影響,并探索其對HepG2細胞遷移較佳抑制作用濃度和時間。

    1 實驗材料

    1.1 細胞

    HepG2細胞(人肝癌細胞)由中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論研究所惠贈。

    1.2 藥物

    雷公藤紅素,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,批號ZL2014635;二甲基亞砜(DMSO),Sigma公司,批號1001731596。

    1.3 主要試劑與儀器

    RPMI Medium 1640、胎牛血清(FBS)、青-鏈霉素、谷氨酰胺、0.25%Trypsin-EDTA、磷酸鹽緩沖液(PBS),GIBCO公司。培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC HERACELL150i CO2 Incubator),超凈臺(Opti.MAIR),離心機(Centrifuge 5415D,Eppendorf),BT224S電子天平(德國Sartouris公司),-80 ℃冰箱(青島海爾),HB-202恒溫水浴箱(北京中西遠大),MP200A電子天平(上海天平儀器廠),YDS-50型液氮罐(北京信康億達科技發(fā)展有限公司)。

    2 實驗方法

    2.1 細胞培養(yǎng)

    細胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)皿,于飽和濕度下37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng);接種HepG2細胞于6孔板中,加入含10%FBS、1%青-鏈霉素、1%谷氨酰胺的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基于飽和濕度下37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞貼壁生長至70%~80%后,劃痕法制造遷移模型,分別加入含藥培養(yǎng)基3 mL,分別于作用后0、6、12、24 h觀察細胞形態(tài)及細胞遷移情況。

    2.2 細胞遷移實驗方法及遷移能力測定

    先用Marker筆在6孔板背后均勻劃橫線,在孔中加入約5×105個HepG2細胞,按“2.1項”方法進行細胞培養(yǎng),用PBS洗細胞3次,去除劃下的細胞。雷公藤紅素以DMSO助溶,實驗組分別稀釋成濃度為5、1、0.5、0.1、0.01 mmol/L的液體,對照組為DMSO組,再以1∶1000分別加入各孔中,置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每組3個孔,每孔取12個視野,共計36個視野。分別于0、6、12、24 h取樣,拍照觀察細胞形態(tài)。應(yīng)用Image J軟件測量劃痕之間距離,比較雷公藤紅素對細胞遷移的影響。計算細胞遷移抑制率。細胞遷移抑制率(%)=(1-各實驗組遷移距離/對照組遷移距離)×100%;細胞遷移速度的計算用0 h劃痕邊沿的距離減去χh劃痕邊沿的距離除以χh,得出不同時間段細胞遷移的速度[3]。

    3 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。部分數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布,細胞遷移計量資料各組間的多重比較采用非參數(shù)檢驗,所有數(shù)據(jù)均用“M(QR)”表示。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 雷公藤紅素對HepG2細胞遷移速度的影響

    經(jīng)不同濃度(5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L)雷公藤紅素處理0、6、12、24 h后,測定不同時間段細胞遷移距離,根據(jù)遷移距離計算速度。結(jié)果顯示,與DMSO組比較, 除0.01 μmol/L組外,雷公藤紅素各濃度組細胞遷移速度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

    表1 各組HepG2細胞不同時間段遷移速度比較[M(QR),μm/h]

    組別 0-6 h 0-12 h 0-24 h

    DMSO組 11.85(0.61) 9.34(0.41) 6.38(0.21)

    5 μmol/L組 5.14(0.52)*

    1 μmol/L組 7.15(0.19)* 5.50(0.27)* 3.61(0.17)*▲

    0.5 μmol/L組 8.77(0.54)*# 6.94(0.31)* 4.61(0.16)*△▲

    0.1 μmol/L組 10.54(0.47)*#△ 8.43(0.27)*△ 5.64(0.21)*△☆▲

    0.01 μmol/L組 11.93(0.43) 9.35(0.33) 6.35(0.20)

    注:與DMSO組比較,*P<0.05;與5 μmol/L組比較,#P<0.05;與

    1 μmol/L組比較,△P<0.05;與0.5 μmol/L組比較,☆P<0.05;與同組0-6 h時點比較,▲P<0.05(下同)

    4.2 雷公藤紅素對HepG2細胞遷移抑制率的影響

    經(jīng)不同濃度(5、1、0.5、0.1、0.01 μmol/L)雷公藤紅素處理0、6、12、24 h后,測定不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞遷移的抑制率。結(jié)果顯示,與DMSO組比較,除0.01 μmol/L組外,雷公藤紅素各濃度組細胞遷移速度抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

    4.3 雷公藤紅素對HepG2細胞形態(tài)的影響

    加入終濃度為5 μmol/L的雷公藤紅素作用6 h時,部分HepG2細胞體變圓、縮小;作用12 h時大部分HepG2細胞體變圓、縮小;作用24 h時HepG2細胞體變圓、縮小,部分細胞成為碎片,培養(yǎng)基表面漂浮死細胞。加入終濃度為1 μmol/L的雷公藤紅素,作用6、12 h時細胞基本正常生長;作用24 h時部分HepG2細胞體變圓、縮小,極少部分細胞成為碎片,培養(yǎng)基表面漂浮死細胞。加入終濃度為0.5、0.1、0.01 μmol/L的雷公藤紅素作用6、12、24 h時細胞基本正常生長。結(jié)果見圖1。

    表2 各組HepG2細胞不同時間段遷移抑制率比較[M(QR),%]

    組別 0-6 h 0-12 h 0-24 h

    DMSO組 0 0 0

    5 μmol/L組 56.49(4.10)*

    1 μmol/L組 40.07(4.09)*# 40.77(3.63)* 43.18(3.06)*

    0.5 μmol/L組 26.14(5.75)*#△ 25.37(3.97)*△ 27.39(3.69)*△

    0.1 μmol/L組 11.25(5.73)*#△☆ 9.41(4.53)*△** 11.14(3.59)*△☆▲

    0.01 μmol/L組 -0.66(6.05) -0.46(4.04) 0.61(3.78)

    0 h 6 h 12 h 24 h

    A

    B

    C

    D

    E

    F

    注:A.DMSO組;B.5 μmol/L組;C.1 μmol/L組;D.0.5 μmol/L組;

    E.0.1 μmol/L組;F.0.01 μmol/L組

    圖1 不同濃度雷公藤紅素作用不同時點HepG2細胞形態(tài)(×100)

    5 討論

    《靈樞·刺節(jié)真邪》認為瘤的病因是“邪居其間,久而內(nèi)著”。一般而言,臨床采用清熱解毒法者尤多,提示腫瘤的病理特點以熱毒為多,即使起于寒毒,亦多從火化,而解毒藥與攻毒類藥合用可能具有拮抗制約中和等效應(yīng)[4]。惡性腫瘤特別是中晚期有轉(zhuǎn)移者常見發(fā)熱、腫塊增大、局部灼熱、疼痛、口渴、便秘、舌紅、苔黃、脈數(shù)等癥,皆屬邪熱瘀毒之候,治療當(dāng)以清熱解毒為法[5]。清熱解毒藥抗癌機理主要為直接抑制腫瘤、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、調(diào)節(jié)機體免疫功能、抗炎、解毒、退熱、阻斷致癌和防突變、抗氧自由基、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性等,并在腫瘤的臨床治療中得到廣泛應(yīng)用[6]。

    雷公藤為衛(wèi)矛科植物雷公藤的根,其味苦、辛,寒,歸肝、腎經(jīng),功效祛風(fēng)除濕、通絡(luò)消腫止痛、解毒殺蟲,苦寒可清熱解毒,用于濕熱結(jié)節(jié)、癌瘤積毒。雷公藤紅素是其研究較多且較為主要的有效成分之一。雷公藤紅素具有廣泛的藥理作用,其抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注。湛氏等[7]研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能夠明顯抑制鼻咽癌細胞株CNE-1的增殖;Tozawa K等[8]研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能夠誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡,并使細胞停滯在G1期;Ge P等[9]發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能夠抑制蛋白酶體的活性;Dai Y等[10]研究表明,雷公藤紅素能夠抑制雄激素非依賴型前列腺癌細胞的增殖、侵害和血管生成;雷公藤紅素可以作用于重組人熱激轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF1)的DNA結(jié)合、HSF1的過磷酸化及熱休克基因的轉(zhuǎn)錄激活[11]。另外有研究顯示,雷公藤紅素對部分多核轉(zhuǎn)錄因子具有雙向調(diào)節(jié)作用,這種現(xiàn)象在其他熱休克蛋白90抑制劑中未見報道[12];吳氏等[13]觀察到雷公藤紅素可以改變Burkitt淋巴瘤細胞株Raji細胞膜超微結(jié)構(gòu);Yadav VR等[14]研究表明,雷公藤紅素能夠通過下調(diào)趨化因子受體CXCR4的表達而抑制結(jié)腸及胰腺癌細胞的侵入和轉(zhuǎn)移。

    本實驗圍繞不同濃度雷公藤紅素在不同時間段對HepG2細胞形態(tài)及細胞遷移的影響進行了研究。結(jié)果表明,HepG2細胞在終濃度為5 μmol/L的雷公藤紅素作用下,6 h內(nèi)能夠抑制HepG2的遷移,6-12 h時使細胞凋亡;在終濃度為1、0.5、0.1 μmol/L時均能夠抑制HepG2細胞的遷移;在終濃度為0.01 μmol/L時對HepG2細胞遷移的抑制作用不明顯。雷公藤紅素對HepG2細胞遷移具有抑制作用,且其對遷移的抑制作用在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,濃度越高其抑制細胞遷移速度的作用越強。

    我們觀察了同一濃度不同作用時間的雷公藤紅素對HepG2細胞形態(tài)及細胞遷移的影響。結(jié)果表明,同一濃度雷公藤紅素在不同時間對HepG2細胞形態(tài)及細胞遷移的抑制作用不同。終濃度為5 μmol/L的雷公藤紅素作用于HepG2細胞6 h時,其對HepG2細胞遷移的抑制作用最明顯,在作用12 h時,細胞出現(xiàn)凋亡。在雷公藤紅素終濃度為1 μmol/L時,作用6、12 h時HepG2細胞基本正常生長;作用24 h時部分HepG2細胞出現(xiàn)凋亡,且對HepG2細胞遷移速度的抑制作用最明顯。雷公藤紅素終濃度為0.5、0.1 μmol/L時,HepG2細胞24 h內(nèi)均基本正常生長,并對HepG2細胞遷移具有抑制作用,且在0-24 h時細胞遷移速度最慢。

    我們還觀察了同一時間不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞形態(tài)及細胞遷移的影響。實驗結(jié)果表明,同一時間不同濃度雷公藤紅素對HepG2細胞形態(tài)的影響及細胞遷移的抑制作用不同。且在0-6 h時以終濃度為5 μmol/L的雷公藤紅素對HepG2細胞遷移抑制作用最明顯;在0-12 h時終濃度5 μmol/L的雷公藤紅素使細胞產(chǎn)生凋亡,此時以終濃度為1 μmol/L的雷公藤紅素對HepG2細胞遷移的抑制作用最明顯;在0-24 h時以終濃度1 μmol/L的雷公藤紅素對HepG2細胞的抑制作用最明顯。

    本研究結(jié)果表明,高濃度雷公藤紅素能夠使HepG2細胞形態(tài)發(fā)生改變并凋亡;雷公藤紅素抑制了HepG2細胞的遷移,且該抑制作用與濃度、時間相關(guān),且在終濃度為5 μmol/L作用于HepG2細胞6 h時,其對HepG2細胞遷移的抑制作用最明顯。因此,從某種角度講,雷公藤紅素可以通過抑制細胞遷移而抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。雷公藤紅素屬于清熱解毒類藥物,該研究結(jié)果符合惡性腫瘤特別是中晚期有轉(zhuǎn)移者皆屬邪熱瘀毒之候,治療當(dāng)以清熱解毒為法之說。故抑制腫瘤細胞遷移亦為清熱解毒藥抗癌機理之一,這在之前的研究較少涉及。另外,我們通過對雷公藤紅素不同濃度、不同作用時間組與對照組進行比較來說明該藥對細胞遷移的影響,還進行了各濃度組之間的多重比較,探索了雷公藤紅素對HepG2細胞遷移較佳抑制作用濃度及時間。

    本研究從細胞水平探索了雷公藤紅素對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響及其較佳作用濃度和時間,其影響HepG2細胞遷移的作用機制值得進一步深入研究探討。

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    (收稿日期:2015-01-04)

    (修回日期:2015-02-04;編輯:華強)

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