HPLC法測定枸櫞酸托法替布的含量

陳嬌婷　詹怡飛

【摘 要】 目的：采用高效液相色譜法測定片劑中枸櫞酸托法替布的含量。方法：以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氫鈉（80∶20）為流動相A，以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鈉（20∶80）為流動相B，梯度洗脫；柱溫為35 ℃；檢測波長為286 nm。結(jié)果：線性范圍為20.02～100.23mg/ml（R=0.9998）；樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定；平均回收率為99.91%，RSD<1.0%（n=9）。結(jié)論：采用高效液相色譜法測定枸櫞酸托法替布的含量，方法靈敏度高，專屬性強，結(jié)果準確可靠。

【關(guān)鍵詞】 HPLC；枸櫞酸托法替布片；含量測定

【中圖分類號】R927.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）17-0023-02

Abstract：Objective To establish the HPLC method for the determination of content of tofacitinib citrate tablets. Methods Octadecyl silane and silica were used as the stationary phase. The mobile phase was consisted of A（acetonitrile： 0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=80∶20） and B（acetonitrile∶0.05 mol/L sodium dihydrogen phosphate=20∶80）. The column temperature was 35℃.The detection wavelength was 286 nm.Results The method was proved to be linear in the range of 20.02～100.23 mg/ml（R=0.9998）； Sample solution was stable in 8h，which the average recovery was 99.91%，RSD<1.0% and the repetity was 1.47%. Conclusion The method was sensitive， specific， reliable.

Keywords：HPLC； Tofacitinib citrate tablets； Content determination

枸櫞酸托法替布（tofacitinib citrate）為美國輝瑞公司（Pfizer）研發(fā)的的一種JAK3激酶抑制劑[1]，臨床主要用于對甲氨蝶呤治療反應不足或不耐受的中度至重度活動性類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的治療。目前，多數(shù)RA藥物通過對細胞外靶點進行調(diào)控來治療RA，而托法替布以細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路為靶點，直接作用于細胞因子網(wǎng)絡的核心部分[2]。托法替布（tofacitinib）對JAK3的抑制強度是JAK1、JAK2的5～100倍[3]，是類風濕性關(guān)節(jié)炎治療的首創(chuàng)藥物（first-in-class drug）。2012年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準該物質(zhì)為藥品上市。筆者對片劑中枸櫞酸托法替布的含量檢測方法進行探索，為枸櫞酸托法替布片劑的質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元泵、自動進樣器、VWD檢測器，美國Agilent 公司）；AB265-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）。

1.2 材料 枸櫞酸托法替布片（杭州民生藥業(yè)有限公司）；枸櫞酸托法替布對照品（批號：120109-178146，中國生物制品檢定所）；甲醇為色譜純；磷酸二氫鉀為分析純；水為超純水；其它試劑為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 供試品溶液 取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量細粉（相當于15mg枸櫞酸托法替布），置25ml量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度；精密量取1.0ml置10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取枸櫞酸托法替布對照品10mg，置50ml量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度；精密量取3.0ml置10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液。

2.1.3 空白輔料溶液 取本品的空白輔料混合物0.2g，置50ml量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為空白輔料溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑；以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鈉（80∶20）為流動相A，以乙腈-0.05mol/磷酸二氫鈉（20∶80）為流動相B，按表1進行梯度洗脫。流速：1.0ml/min；檢測波長：286nm。理論板數(shù)按托法替布峰計算不低于3500。

2.3 空白輔料干擾試驗 精密吸取供試品溶液，對照品溶液和空白輔料溶液各10μl，注入色譜儀中，記錄色譜圖。在托法替布相應的保留時間處，空白輔料溶液無相關(guān)吸收峰，對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察 取枸櫞酸托法替布對照品約5mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度；精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置10ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，制成梯度濃度溶液；精密量取10μl，記錄峰面積，以峰面積A為縱坐標，樣品濃度C（以枸櫞酸托法替布計）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程y=536x+3.28，r=0.9998。試驗結(jié)果表明，枸櫞酸托法替布在20.02～100.23mg/ml之間，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗 取線性及范圍項下的0.06mg/ml溶液，連續(xù)進樣6次，考察儀器精密度。結(jié)果RSD為0.87%（n=6），表明儀器的精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取線性及范圍項下的 0.06mg/ml溶液，分別在0、2、4、6、8h進樣10μl，計算其含量。RSD為1.32%（n=5），表明樣品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足樣品測試要求。

2.7 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按照供試品溶液配制方法配制溶液，進樣10μl，樣品含量平均值為99.53%，RSD為1.47%（n=6）。表明該方法的重復性較好。

2.8 中間精密度試驗 由不同試驗人員于不同時間使用不同儀器，照上述方法測定同一批號樣品的含量，平行測定6次。結(jié)果樣品的平均含量98.49%，RSD為1.52%，表明該方法的中間精密度較好。

2.9 回收率試驗 采用模擬回收率試驗方法，取本品12、15、18mg各三份，分別于25ml容量瓶中，加入空白輔料0.2g，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，精密量取1ml至10ml容量瓶，按照上述條件進行測定，計算含量和回收率。結(jié)果平均回收率為99.91%，RSD<1.0%（n=9），見表2。

2.10 樣品含量測定 取樣品三批，按照“2.1.1”項下制備方法制備供試品溶液，進樣10μl，采用外標法，以峰面積計算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測方法的篩選 枸櫞酸托法替布含量測定方法學考察過程中，曾試過不同的流動相進行試驗，試圖通過等梯度的流動相，將枸櫞酸托法替布分離出來，達到系統(tǒng)適用性的要求，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)其效果并不明顯。因此采用不同梯度的流動相進行洗脫。

3.2 溶液配制方法 枸櫞酸托法替布片規(guī)格為5mg，單片片重比較小，供試品溶液和對照品的溶液，最終選擇2次配置的方式來實現(xiàn)，這有助于檢測人員操作，減少實驗相對誤差。

參考文獻

[1] 范鳴.抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥Tofacitini [J].藥學進展，2011，35（10）：480.

[2] Kunihiro Y， Satoshi K， Koshiro S， et al. JAK inhibitor： tofacitinib， a new disease modifying anti-rheumatic drug [J]. Inflamm Regener， 2011， 31（4）： 349-353.

[3]Vijayakrishnan L， Venkataramanan R， Gulati P. Treating inflammation with the janus kinase inhibitor CP-690550 [J]. Trends Pharm Sci， 2011， 32（1）： 25-34.

（收稿日期：2015.05.18）