2，3－二氨基萘衍生化－氣相色譜－質(zhì)譜法測定血漿中的亞硝酸鹽含量＊

劉國杰， 申小愛， 劉俊亭

（1.中國醫(yī)科大學(xué) 公共基礎(chǔ)學(xué)院 化學(xué)教研室，遼寧 沈陽110122；2.中國醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽110122）

近年來，臨床醫(yī)學(xué)對體內(nèi)亞硝酸鹽的研究日趨活躍.研究證實NO2－能和人、動物體中的二級胺或三級胺結(jié)合轉(zhuǎn)化成強致癌物質(zhì)亞硝胺，從而誘發(fā)癌變［1，2］.此外，最新的研究證實，NO2－在一些動物疾病模型中具有細胞保護作用，它能夠抑制缺血和再灌注帶來的心肌損傷［3，4］，減少梗塞面積，恢復(fù)心室功能［5］等，在預(yù)防和治療心血管疾病中具有重大意義.在臨床醫(yī)學(xué)亞硝酸鹽的研究中，體液內(nèi)NO2－含量的測定貫穿于實驗的始終，成為影響研究進展的關(guān)鍵所在.GC－MS法具有靈敏度高、分析速度快和鑒別能力強等特點，在生物樣品分析中占有重要地位.但由于NO2－是水溶性無機陰離子，必須經(jīng)過衍生化轉(zhuǎn)換成極性小、揮發(fā)性強的物質(zhì)，再進行GC－MS檢測.文獻方法中NO2－的衍生化試劑有苯、三甲氧基苯、甲苯［7，8］、PFB－Br［9～15］，這些方法普遍具有操作復(fù)雜、耗時長及易受干擾等特點，因此，研究一種快速準確地測定生物樣品中亞硝酸鹽含量的方法，在臨床醫(yī)學(xué)研究中具有實際應(yīng)用價值.

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

亞硝酸鹽血漿標(biāo)準溶液，普羅地芬（SKF525A）內(nèi)標(biāo)溶液，2，3－二氨基萘溶液，甲醇，丙酮，異丙醇，乙酸乙酯，磷酸二氫鈉，磷酸氫鈉，碳酸銨.

Shimadzu GC－MS－QP2010，Rtx－5（10m×0.18mm×0.2μm），pH 測定儀，旋渦混合器，精密電子天平，TDZ4－WS臺式離心機.

1.2 分析方法

取0.5mL血漿于試管中，加入pH＝3的磷酸緩沖溶液1mL，10μL 2，3－DAN溶液，60℃水浴中加熱10min，冷卻后，加入內(nèi)標(biāo)；加入碳酸銨調(diào)pH至8.5，2mL乙酸乙酯萃取，震蕩1min，離心；取上清液N2氣下濃縮至近干，吸取1μL GC－MS分析.柱溫程序：柱初始溫度為60℃，保持1 min后以15℃／min升至270℃，保持8min；EI離子源，電子能量為70eV，進樣口溫度為250℃，接口溫度為270℃，離子源溫度為200℃，檢測器溫度為200℃.GC－MS法分析采用全掃描（Scan）和選擇離子檢測（SIM）兩種方式.以標(biāo)準溶液濃度為橫坐標(biāo)，SIM色譜圖中NO2－衍生物m／z 141的峰面積和內(nèi)標(biāo)m／z86的峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，進行定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化反應(yīng)機理

衍生化反應(yīng)中，2，3－DAN和NO2－發(fā)生重氮化反應(yīng)，然后與另一個氨基分子內(nèi)縮合成環(huán)，生成1H－萘并［2，3－d］［1，2，3］三唑［6］，機理見圖1，產(chǎn)物可在 NIST譜庫檢索出.

2.2 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

衍生化反應(yīng)過程中，反應(yīng)液溫度和pH值是影響重氮化的重要因素.實驗中分別探索了20℃、40℃、60℃和80℃下衍生化反應(yīng)的情況.結(jié)果表明：隨著溫度的升高，衍生化反應(yīng)效率升高；當(dāng)溫度大于60℃時，衍生化產(chǎn)物的響應(yīng)值明顯高于室溫下的響應(yīng)值.因此，本實驗的衍生化溫度選擇60℃.實驗中，分別加入pH＝2，2.5，3，4，5，6，7，8的磷酸鹽緩沖溶液，進行2，3－DAN 衍生化.實驗數(shù)據(jù)證實pH在2～3之間，衍生化產(chǎn)物逐漸增加；pH＝3時，衍生化產(chǎn)物達到最大值；pH＞3時，兩種衍生化產(chǎn)物迅速減少.因此，反應(yīng)介質(zhì)選擇pH＝3的緩沖溶液.由于該衍生化的反應(yīng)速度尚未有文獻報道，因此考察了反應(yīng)時間對2，3－DAN衍生化反應(yīng)的影響.實驗結(jié)果顯示：反應(yīng)5min后衍生化產(chǎn)物量明顯增加，10min后，產(chǎn)量增加的趨勢減緩，因此，本實驗的衍生化時間選擇為10min.

2.3 血漿中NO2－經(jīng)衍生化后的色譜圖

血漿中NO2－經(jīng)2，3－DAN衍生化后，NO2－衍生物的保留時間為11.15min；內(nèi)標(biāo)的保留時間為12.35min；剩余的2，3－DAN衍生化試劑的保留時間為9.32min.色譜圖分離度好、峰形尖銳、靈敏度高.圖2為總離子流色譜圖，圖3為選擇離子流色譜圖.掃描時間范圍為0～20min.NO2－衍生化產(chǎn)物特征離子（m／z）為：114，141和169；內(nèi)標(biāo)物SKF525A特征離子（m／z）為：86和99.

2.4 標(biāo)準曲線及檢測限

本實驗選用內(nèi)標(biāo)法制備標(biāo)準曲線，以標(biāo)準溶液濃度為橫坐標(biāo)，以選擇離子色譜圖中NO2－衍生物 m／z 141的峰面積和內(nèi)標(biāo)m／z86的峰面積之比為縱坐標(biāo)，如圖4.實驗結(jié)果表明血漿標(biāo)準溶液中亞硝酸根離子在0.05～20μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.線性方程為y＝0.162 5 x＋0.006 4，相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 5.檢測限按照三倍信噪比計算，該方法測定血漿標(biāo)準溶液中NO2－的檢測限LOD為0.005μg／mL.

2.5 精密度和回收率的考察

取高（10μg／mL）、中（1μg／mL）、低（0.1μg／mL）3個濃度的血漿標(biāo)準溶液進行分析，日內(nèi)精密度（n＝4）為3.43%～4.61%，日間精密度（n＝5）為4.25%～5.89%，NO2－回收率為89.43%～115.6%.

2.6 NO2－衍生物的穩(wěn)定性

在標(biāo)準NO2－水溶液中，按照上述處理方法進行2，3－DAN衍生化，得到衍生化產(chǎn)物后置于4℃的冰箱中冷藏，分別于0、2、4、6、8、12、24h后測定 NO2－離子的濃度.2，3－DAN 衍生化產(chǎn)物RSD%為2.11%.實驗結(jié)果表明衍生物在4℃下具有良好的穩(wěn)定性.

2.7 血漿樣品分析

取非吸煙正常人靜脈血血漿0.5mL，按照1.2分析方法平行測定3次，測得NO2－含量均值為0.354μg／mL.

3 結(jié) 論

2，3－DAN衍生化－GC－MS法無需相轉(zhuǎn)移催化劑，可直接對血漿中的NO2－進行衍生化，該方法具有操作簡便快捷、耗時更短、檢測限更低、準確度和精密度高的優(yōu)點，適于臨床醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用.

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