光照時間對興國灰鵝產(chǎn)蛋和PRL、FSHβ、LH m RNA 表達的影響

黃江南，劉林秀，武艷平，康昭風(fēng)，韋啟鵬，周泉勇，季華員，曾 文，陳受金，謝金防*

(1．江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200;2．江西省興國縣灰鵝生產(chǎn)辦公室，江西 興國 342400)

鵝的繁殖活動具有明顯的季節(jié)性，而光照是調(diào)控鵝季節(jié)性繁殖的重要因子。光照通過家禽視網(wǎng)膜上的感受器刺激下丘腦，促使下丘腦分泌促性腺激素釋放激素(gonadotrophin，GnRH)和血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，GnRH通過腦垂體門脈系統(tǒng)傳至垂體前葉和后葉引起卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的分泌，最終促進卵巢中卵泡的發(fā)育和排卵［1］。同時，在下丘腦-垂體-性腺軸中，VIP可促進促乳素(PRL)分泌，PRL的分泌量最終在升高到一定閾值時，會反饋性地抑制下丘腦GnRH的分泌，從而終止繁殖活動和繁殖季節(jié)［2］。

興國灰鵝是我國著名的優(yōu)良中型灰鵝品種資源之一，它的形成已有1 700多年歷史，具有耐粗飼、生長快、肉質(zhì)鮮嫩、抗逆性強等特性，是我國家禽品種資源基因庫中的寶貴鵝遺傳資源，已列入我國畜禽遺傳資源國家級保護名錄。興國灰鵝的繁殖同樣具有明顯的季節(jié)性，在自然條件下，每年從9月份開始進入繁殖期，至次年的4月份左右停產(chǎn)，為短日照繁殖類型鵝種［3-4］。

在興國灰鵝前期的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)興國灰鵝處于停產(chǎn)期時，通過縮短光照可促使其重新產(chǎn)蛋，且PRL基因在短光照處理組的垂體和輸卵管中表達量均顯著低于自然光照組［1，5］。因此，本試驗在此基礎(chǔ)上，進一步開展了長光照對興國灰鵝產(chǎn)蛋量及產(chǎn)蛋性狀相關(guān)基因在下丘腦-垂體-性腺軸表達水平的影響，以期進一步增進對光照調(diào)控興國灰鵝季節(jié)性繁殖內(nèi)分泌機制的認(rèn)識。

1 材料與方法

1．1 試驗設(shè)計與樣品采集

1．1．1 試驗地點 飼養(yǎng)試驗在江西省興國灰鵝原種場進行。

1．1．2 試驗分組 選擇健康、體重均勻且同年齡的興國灰鵝84只，分為對照組和實驗組，試驗組35只母鵝，對照組 35 只母鵝，公∶母=1∶5。

1．1．3 試驗時間 試驗時間從2013年10月3號開始，至2013年12月3日結(jié)束。

1．1．4 光照控制 試驗組的鵝接受遞增式長光照處理，每周增加 1～2 h光照，第1周每天18:00將鵝驅(qū)趕入蔽光的鵝舍，次日06:00將鵝從鵝舍放出，控制鵝群每天接受13 h的自然光照。第2周光照15 h，即每天18:00時將鵝驅(qū)趕入蔽光的鵝舍，次日04:00開白熾燈(30～50 lx)補光至天亮，將鵝從鵝舍放出。第3周光照17 h，即每天天黑前時將鵝驅(qū)趕入鵝舍，開白熾燈(30～50 lx)至21:00，次日05:00開白熾燈(30～50 lx)補光至天亮，將鵝從鵝舍放出。第4周開始光照18 h，持續(xù)到第8周，即每天天黑前時將鵝驅(qū)趕入鵝舍，開白熾燈(30～50 lx)至22:00，次日04:00開白熾燈(30～50 lx)補光至天亮，將鵝從鵝舍放出。整個試驗階段，對照組的鵝接受自然光照，第1個月接受自然光照的平均時間為12．89 h，第2個月接受自然光照的平均時間為11．78 h。

1．1．5 數(shù)據(jù)記錄 試驗組和對照組其他環(huán)境條件一致。每天定時收集蛋，記錄各組每天總產(chǎn)蛋數(shù)并計算產(chǎn)蛋率。每3～4 d檢查1次就巢，并觀察換羽情況，被確認(rèn)就巢的母鵝被隔離限飼7～10 d以強制終止就巢，然后重新歸群。

1．1．6 樣品采集 當(dāng)試驗結(jié)束，分別挑選試驗組處于停產(chǎn)期和對照組處于產(chǎn)蛋期的3只鵝進行屠宰，收集下丘腦、垂體、卵巢和輸卵管組織，放入液氮中速凍，-70℃冷凍保存。

1．2 所用試劑及儀器

1．2．1 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen公司，凝膠電泳用瓊脂糖為西班牙生產(chǎn)，引物合成和基因序列測序服務(wù)均由上海Invitrogen公司提供，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和熒光定量試劑盒試劑盒均購自Toyobo公司。

1．2．2 主要儀器設(shè)備 梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)，Nano Drop2000核酸/蛋白質(zhì)濃度測定儀(美國Thermo scientific公司)，熒光定量PCR儀器(美國ABI公司)。

1．3 組織總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

采用Trizol法提取組織中的總RNA，提取的RNA用Thermo scientific公司的NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀測定總RNA濃度。

cDNA的合成利用Toyobo公司的cDNA的合成試劑盒(ReverTra Ace? qPCR RT Master Mix with gDNA Remover)完成，先在65℃溫育5 min將RNA變性后，置于冰上，加入DNaseI混合液，37℃溫育5 min去除基因組DNA，再加入5×RTMaster Mix II，37℃溫育15 min，在98℃溫育5 min以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA可于-20℃ 保存。

1．4 熒光定量PCR檢測引物的設(shè)計

根據(jù)GenBank登錄的FSHβ(EU563911)、LHβ(DQ023159)、管家基因β-actin(M26111)基因序列，應(yīng)用Premier 5．0軟件設(shè)計定量檢測引物。PRL基因的引物序列引用張旭(2010)等的研究［6］。通過PCR擴增，篩選擴增特異性較好的引物作為熒光定量檢測的引物，引物序列如表1所示。

表1 用于熒光定量檢測的引物Tab．1 The primers for qPCR

1．5 熒光定量PCR檢測

反應(yīng)體系為 20 μL，其中 cDNA 0．8 μL，SYBR green IMix 10 μL，ROX 0．4 μL，正反向引物各0．4μmol/L，其余用滅菌純凈水補足。樣品在96孔板混合均勻后直接放入ABI 7300實時定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)程序為95℃ 10 s，1個循環(huán)，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，95℃ 15 s，60℃30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，1個循環(huán)。每個基因的各個樣品都與內(nèi)參基因的引物同時擴增，反應(yīng)的相對量以目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的Ct值(取3個重復(fù)的平均值)的差值△Ct計算，再選取△Ct最大作為參照，用其它樣品的△Ct減去參照△Ct得到△△Ct，Ct值大于35的視為無效數(shù)據(jù)。

1．6 數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)蛋曲線為日產(chǎn)蛋率曲線，日產(chǎn)蛋率=日產(chǎn)蛋總數(shù)/母鵝總數(shù)(包括就巢鵝)×100%。應(yīng)用Excel軟件對熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行分析，根據(jù)所測得的內(nèi)參基因和目的基因的Ct值計算目的基因的相對表達量，根據(jù)Ct值推導(dǎo)得出目的基因的量=2-△△Ct。Ct是熱循環(huán)儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強度值，△△Ct=△Ct目的基因-Ct管家基因，△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因［7］，計算出樣品中目的基因 mRNA 與內(nèi)參基因 βactin相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2．1 產(chǎn)蛋情況

試驗組在30 d達到產(chǎn)蛋高峰，產(chǎn)蛋率達17%，到38 d就開始下降，于50 d停產(chǎn) (圖1A)。對照組在整個試驗期間持續(xù)產(chǎn)蛋，到15 d達到一個產(chǎn)蛋高峰，產(chǎn)蛋率達到21%(圖1B)。整個試驗期間，試驗組的平均日產(chǎn)蛋率為8．2%，對照組的平均日產(chǎn)蛋率為8．8%。

圖1 不同光照對興國灰鵝日產(chǎn)蛋率的影響Fig．1 Effects of light exposure on egg production

2．2 組織RNA的提取與檢測

收集了試驗組和對照組鵝的下丘腦、垂體、輸卵管、卵巢組織各3份，共24個組織樣品。在利用Trizol法提取RNA后用1．5%的瓊脂糖膠檢測完整性，得到的結(jié)果如圖2，由圖2可以看出，28S比18S亮，說明RNA完整性很好。進一步利用核酸濃度測定儀對所提取的總RNA進行檢測，結(jié)果顯示總RNA濃度在400～1 800 ng/μL之間，A260/A280在1．9～2．1之間，RNA的純度和濃度均達到實驗要求。

圖2 鵝4個組織的RNA瓊脂糖膠檢測Fig．2 Agarose gel(1．2%)showing RNA from tissues of goose

2．3 β-actin、PRL、FSHβ和LH基因的擴增曲線和溶解曲線

β-actin、PRL、FSHβ、LH 基因的擴增曲線走勢正常，呈典型的S型曲線(圖3)。且 β-actin、PRL、FSHβ、LH 基因的融解曲線均呈單一尖峰(圖4)，表明設(shè)計的引物特異性好，無引物二聚體和非特異產(chǎn)物，可用于基因表達量的檢測。

圖3 β-actin、PRL、FSHβ和LH基因的擴增曲線Fig．3 The amplification curves ofβ-actin、PRL、FSHβ and LH gene

圖4 β-actin、PRL、FSHβ和LH基因的溶解曲線Fig．4 Themelt curves ofβ-actin、PRL、FSHβ and LH gene

圖5 光照對興國灰鵝下丘腦-垂體-性腺軸中PRL基因mRNA表達水平變化影響Fig．5 Effects of light exposure on the expression of PRL gene in hypothalamus-pituitary-gonad axis of Xingguo grey geese

圖6 長光照對興國灰鵝下丘腦-垂體-性腺軸中FSHβ基因mRNA表達水平變化影響Fig．6 Effects of light exposure on the expression of FSHβ gene in hypothalamus-pituitary-gonad axis of Xingguo grey geese

2．4 PRL基因的表達量檢測

PRL基因在試驗組和對照組的垂體、輸卵管和卵巢組織中不存在顯著的表達差異(圖5)，但在下丘腦組織中，試驗組的表達量顯著的高于對照組(FC=10．3，P=0．03)。

2．5 FSHβ基因的表達量檢測

FSHβ基因在試驗組和對照組的下丘腦組織中不存在表達差異，在垂體組織中存在差異表達，但是差異不顯著(圖6)。在輸卵管和卵巢組織中，試驗組的表達量極顯著的高于對照組(FC=4．3，P=0．001 2 和 FC=2．5，P=0．007)。

圖7 長光照對興國灰鵝下丘腦-垂體-性腺軸中LHβ基因mRNA表達水平變化影響Fig．7 Effects of light exposure on the expression of LHβ gene in hypothalamus-pituitary-gonad axis of Xingguo grey geese

2．6 LH基因的表達量檢測

LH基因在試驗組和對照組的下丘腦、垂體、輸卵管組織中不存在顯著的表達差異(圖7)。但在卵巢組織中，試驗組的表達量顯著的低于對照組(FC=0．22，P=0．04)。

3 討論與結(jié)論

光照時間對鵝的產(chǎn)蛋性能存在著顯著的調(diào)節(jié)作用。施振旦等報道，短光照可促進廣東灰鵝的繁殖活動，而長光照則抑制廣東灰鵝的繁殖活動，同時，冬季延長光照可降低其飼料報酬［8-9］。且通過人工補照12～13．5 h，可使鵝產(chǎn)蛋高峰期提前，提高產(chǎn)蛋量［10］。在本實驗室的前期研究中，4月至9月期間，在短光照處理下(11 h)的興國灰鵝日產(chǎn)蛋率，顯著高于自然光照組(14～15 h)［11］。本研究中，在江西省氣候條件下，冬季10月份開始，通過光遞增方式的光照調(diào)控程序可以使種鵝很快停產(chǎn)，提前進入休產(chǎn)期。這說明通過控制光照時間，可以調(diào)節(jié)興國灰鵝的繁殖性能，與其它鵝種中的相關(guān)研究結(jié)果一致。通過這些研究，可為探討興國灰鵝的可操作性的光照程序和均衡繁殖技術(shù)推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

禽類的繁殖季節(jié)調(diào)控理論認(rèn)為這種原先促進繁殖活動的長日照最后抑制繁殖活動使繁殖季節(jié)終止的現(xiàn)象，一般被稱為“光不應(yīng)”或“光鈍化”現(xiàn)象。這一“光鈍化”現(xiàn)象應(yīng)該與PRL的分泌有很大關(guān)系［12-13］。在本試驗中，經(jīng)過遞增式長光照處理，鵝下丘腦PRL基因表達量顯著的高于對照組，長光照對PRL分泌的促進結(jié)果與已報道在馬崗鵝的PRL季節(jié)性分泌的結(jié)果相一致［14］。黃運茂等研究發(fā)現(xiàn)，延長光照能使PRL質(zhì)量濃度上升、LH下降，母鵝進入休產(chǎn)期并完成換羽［14-15］。本研究中，長光照處理下鵝卵巢中LH基因表達水平顯著低于自然光照組，可能是由于長光照處理導(dǎo)致的鵝下丘腦中PRL基因表達量的上升，通過下丘腦-垂體-性腺軸作用，最終抑制LH基因的表達。在杜曉東的研究報道中，自然光照周期下，產(chǎn)蛋期鵝卵巢FSHβ基因的表達量低于休產(chǎn)期［16］。本試驗中發(fā)現(xiàn)對照組的產(chǎn)蛋鵝輸卵管和卵巢中FSHβ基因的表達水平都顯著高于長光照處理的休產(chǎn)的興國灰鵝，這與自然光照周期下的表達規(guī)律不一致，說明長光照處理可能導(dǎo)致鵝的內(nèi)分泌出現(xiàn)紊亂，使輸卵管和卵巢中FSHβ基因的表達快速上升。

綜上所述，光照時間長短影響了興國灰鵝下丘腦-垂體-性腺軸中激素的合成代謝。通過延長光照，可促使興國灰鵝生殖軸中PRL基因的表達水平上升，并通過旁分泌的方式，促進FSHβ基因的表達，抑制LH基因的表達［14，17］，從而導(dǎo)致卵巢、輸卵管等組織中FSHβ和LH表達比例失調(diào)，最終影響FSHβ和LH的協(xié)同作用，致使興國灰鵝很快停產(chǎn)。

［1］周麗，楊海明，王志躍，等．鵝季節(jié)性繁殖的生理特點及調(diào)節(jié)措施［J］．水禽世界，2010，15(5):40-43．

［2］黃運茂．馬崗鵝繁殖活動的調(diào)控研究［D］．廣州:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005．

［3］謝金防，劉林秀，武艷平，等．興國灰鵝季節(jié)性繁殖控制技術(shù)研究初報［J］．江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23(12):137-139．

［4］朱勇文．光照對家禽生產(chǎn)的影響［J］．飼料博覽，2011(2):8-10．

［5］施振旦，孫愛東，黃運茂，等．廣東鵝種的反季節(jié)繁殖光照調(diào)控原理和技術(shù)［J］．中國家禽，2007，29(19):40-42．

［6］張旭，康波，宿甲子，等．性成熟前籽鵝 PRL及PRLR mRNA表達量的動態(tài)變化［J］．黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，2010，22(1):49-52．

［7］張響英，卞有慶，唐現(xiàn)文，等．VIP基因在獅頭鵝繁殖周期下丘腦-垂體-性腺軸中的表達變化［J］．河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42(3):121-124．

［8］施振旦，黃運茂，孫愛東，等．光照對廣東灰鵝繁殖季節(jié)性的影響研究［J］．廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(3):72-75．

［9］王利剛，王健，狄和雙，等．光照周期對鵝產(chǎn)蛋和血清中相關(guān)生殖激素水平的影響［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(5):178-179．

［10］Wang CM，Chen L R，Lee SR，etal．Supplementary artificiallight to increase egg production of geese under natural lightingconditions［J］．Anim Reprod Sci，2009，113(1/4):317-321．

［11］武艷平，霍俊宏，熊興華，等．光照對興國灰鵝 PRL基因表達的影響［J］．福建農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，28(10):943-946．

［12］Sharp P J．Strategies in avian breeding cycles［J］．Animal Reproduction Science，1996，42(1):505-513．

［13］Sharp P J，Blache D A．Neuroendocrinemodel for prolactin as the keymediator of seasonal breeding in birds under long-and short-day photoperiods［J］．Cannadian Journal of Physiology and Pharmacology，2003，81(4):350-358．

［14］黃運茂，施振旦，李孝偉，等．光周期對馬崗鵝產(chǎn)蛋 PRL和LH分泌季節(jié)性變化的影響［J］．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，28(3):94-96，104．

［15］陳永華，蔡鳳仙，楊海明，等．自然光周期條件下種鵝血清生化指標(biāo)和生殖激素水平變化規(guī)律的研究［J］．中國家禽，2012，34(12):34-37．

［16］杜曉東．鵝生殖周期FSHβ基因mRNA表達規(guī)律的研究［D］．合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009．

［17］施振旦，黃運茂，吳偉．鵝產(chǎn)蛋周期及其生理學(xué)調(diào)控機制研究的回顧［J］．中國家禽，2008，30(9):1-5．