SEMA3B、AEG1蛋白在食管癌組織中的表達(dá)及臨床意義

賈建博，辛向兵，朱愛林，韓勇，王濤

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸腔外科，西安 710038

食管癌患者的預(yù)后較差，其整體病死率較高[1]。隨著病情持續(xù)性進(jìn)展，食管癌患者的生存時(shí)間明顯縮短，5年生存率明顯下降[2]。基礎(chǔ)方面的研究顯示，信號(hào)素3B（semaphorin 3B，SEMA3B）蛋白表達(dá)上調(diào)時(shí)，能夠通過抑制下游腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄基因的激活，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)炎癥信號(hào)通路的激活程度，最終降低腫瘤細(xì)胞異常增殖的風(fēng)險(xiǎn)[3]。星型細(xì)胞上調(diào)基因 1（astrosyte elevated gene 1，AEG1）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，其可以對(duì)腫瘤細(xì)胞的核DNA分裂進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的持續(xù)性自我增殖[4]。本研究對(duì)食管癌組織中SEMA3B、AEG1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并對(duì)上述指標(biāo)與食管癌患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2018年4月于空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受治療的120例食管癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜79歲；②經(jīng)食管鏡取活組織診斷為食管癌，且術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為食管癌；③無放化療及免疫治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性食管癌。本研究共納入食管癌患者120例，其中，男67例，女53例；年齡45～72歲，平均（57.0±7.6）歲；TNM分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期61例，Ⅲ期23例，Ⅳ期6例；分化程度：高分化30例，中分化58例，低分化32例；浸潤深度：T1～249例，T3～471例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移67例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌106例，其他14例。收集120例食管癌患者的食管癌組織標(biāo)本和對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化染色法檢測(cè)不同組織中SEMA3B、AEG1蛋白表達(dá)

取食管癌組織和癌旁組織標(biāo)本，采用石蠟切片，脫水操作后采用3%H2O2于室溫條件下孵育20 min；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗3次，每次5 min；隨后采用山羊血清封閉抗體5 min，倒去血清后不清洗，加入SEMA3B、AEG1一抗（濃度：1∶1000）5 ml，37 ℃孵育2 h，PBS清洗3次，每次5 min；加入生物素?zé)晒鈽?biāo)記的二抗（濃度：1∶12 000）3 ml，37 ℃孵育 20～30 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入鏈霉親合素/辣根過氧化物酶（horseradish peroxidas，HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，37 ℃孵育20～30 min，PBS清洗 3次，每次5 min；采用增強(qiáng)型HRP-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）底物顯色試劑盒顯色，自來水沖洗，復(fù)染，封片。

1.3 免疫組化染色法結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

SEMA3B蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，AEG1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，兩者陽性著色均呈黃色、棕黃色、褐色顆粒。根據(jù)著色強(qiáng)度評(píng)分：0分，無色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，褐色或黑色。根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分：陽性細(xì)胞所占比例≤10%計(jì)1分，陽性細(xì)胞所占比例為11%～50%計(jì)2分，陽性細(xì)胞所占比例為51%～75%計(jì)3分，陽性細(xì)胞所占比例＞75%計(jì)4分。將著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分相乘，總分＜3分判定為蛋白陰性表達(dá)，≥3分判定為蛋白陽性表達(dá)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)不同組織中SEMA3B、AEG1蛋白表達(dá)

采用冰上組織機(jī)械研磨的方法收集食管癌組織細(xì)胞，每10 g食管癌組織加入5 ml細(xì)胞裂解液，1500 r/min離心15 min，收集上清液；隨后加入二喹啉甲酸檢測(cè)蛋白濃度，按照檢測(cè)蛋白與緩沖液1∶5的比例進(jìn)行煮沸，以每孔50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳、封閉和轉(zhuǎn)膜，加入 SEMA3B、AEG1抗體（1∶800），4℃下過夜孵育，去除相關(guān)液體后采用TBST清洗3次，每次5 min；加入SEMA3B、AEG1二抗（1∶1500），TBST清洗3次，每次5 min，進(jìn)行顯影劑顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色法檢測(cè)不同組織中SEMA3B、AEG1蛋白的表達(dá)情況

免疫組化染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌組織中SEMA3B蛋白的陽性表達(dá)率為39.2%（47/120），明顯低于癌旁組織的70.0%（84/120），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=23.010，P＜0.01）；食管癌組織中AEG1蛋白的陽性表達(dá)率為75.8%（91/120），明顯高于癌旁組織的28.3%（34/120），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=54.244，P＜0.01）。

2.2 Western blot 法檢測(cè)不同組織中SEMA3B、AEG1蛋白的表達(dá)情況

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，食管癌組織中SEMA3B蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，AEG1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 食管癌組織及癌旁組織中SEMA3B、AEG1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表1 食管癌組織及癌旁組織中SEMA3B、AEG1蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

組織類型SEMA3B蛋白AEG1蛋白食管癌組織（n=120）癌旁組織（n=120）t值P值0.771±0.160 1.302±0.271 18.483 0.000 1.631±0.280 0.583±0.140 36.672 0.000

2.3 食管癌組織中SEMA3B、AEG1蛋白表達(dá)與食管癌患者臨床特征的關(guān)系

TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中SEMA3B蛋白的陽性表達(dá)率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.480、9.634，P＜0.05）；TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中AEG1蛋白的陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.224、7.643、15.589，P＜0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中SEMA3B、AEG1蛋白的陽性表達(dá)情況

3 討論

食管黏膜上皮細(xì)胞在長期損傷修復(fù)的過程中，部分癌基因突變或癌基因誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞異常分裂，能夠促進(jìn)食管癌的病情進(jìn)展。在長期吸煙、高溫飲食或過度飲酒的人群中，食管癌的發(fā)病率明顯增高[5]。已有研究表明，部分地區(qū)食管癌的發(fā)病率可超過845/10萬，同時(shí)在合并有相關(guān)家族史的群體中，食管癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[6-8]。本研究對(duì)食管癌患者食管癌組織中SEMA3B、AEG1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并對(duì)SEMA3B、AEG1蛋白表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系進(jìn)行探討，以期為臨床食管癌患者的診療提供參考。

SEMA3B是信號(hào)素調(diào)控因子，能夠通過與腫瘤細(xì)胞膜上的跨膜蛋白受體相結(jié)合，拮抗腫瘤細(xì)胞中第二信使的激活，阻斷腫瘤細(xì)胞中絲裂原激活蛋 白 激 酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）及p16信號(hào)通路。分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究認(rèn)為，SEMA3B還能夠抑制癌基因的激活，提高細(xì)胞對(duì)錯(cuò)配基因的修復(fù)能力；AEG1是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其可以通過激活轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，上調(diào)腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高腫瘤細(xì)胞的自我增殖速度[9-10]。一項(xiàng)探討了SEMA3B在食管癌患者中表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，相比于良性食管病變組織，食管癌患者食管癌組織中SEMA3B蛋白的陽性表達(dá)率明顯降低，但該研究對(duì)食管癌組織中AEG1表達(dá)情況的分析尚不足[11]。

本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中SEMA3B蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，而AEG1蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示SEMA3B、AEG1蛋白異常表達(dá)可能與食管癌的發(fā)生有關(guān)。SEMA3B蛋白的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致其對(duì)腫瘤細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白的穩(wěn)定作用被削減，腫瘤細(xì)胞內(nèi)不同信號(hào)通路受體被異常激活，從而促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生；AEG1蛋白表達(dá)水平增高，能夠提高腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄開放閱讀區(qū)的開放程度，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程。張道省[12]研究表明，食管癌組織中AEG1蛋白的陽性表達(dá)率隨食管癌患者的病情嚴(yán)重程度逐漸增高；患者的臨床預(yù)后越差，AEG1蛋白的陽性表達(dá)率越高。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中SEMA3B蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，而AEG1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.01），提示在食管癌患者中同樣存在明顯的SEMA3B、AEG1的差異性表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中SEMA3B蛋白的陽性表達(dá)率分別低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），提示SEMA3B蛋白可能參與了食管癌的病情進(jìn)展過程，究其原因可能為SEMA3B蛋白表達(dá)下調(diào)，能夠影響食管癌細(xì)胞對(duì)深肌層及淋巴結(jié)組織的浸潤能力；本研究還發(fā)現(xiàn)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中AEG1蛋白的陽性表達(dá)率分別高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），表明AEG1蛋白表達(dá)與食管癌患者的病情進(jìn)展密切相關(guān)。

綜上所述，食管癌患者食管癌組織中SEMA3B蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而AEG1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且SEMA3B、AEG1蛋白表達(dá)與食管癌患者的臨床特征有關(guān)。希望后續(xù)研究能夠探討SEMA3B、AEG1蛋白的表達(dá)與食管癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。