腦卒中后抑郁大鼠行為學的動態(tài)變化及中藥補陽還五湯的干預作用

羅 琳，鄧叔華，易 健，周賽男，佘 顏，劉柏炎，2

(1.湖南中醫(yī)藥大學，長沙 410208;2.益陽醫(yī)學高等?？茖W校，益陽 413000)

腦卒中是一種對人類健康和生命安全造成極大威脅的難治性疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點。卒中不僅導致患者運動功能障礙出現(xiàn)偏癱，同時患者也出現(xiàn)不同程度的心理、認知和語言功能的障礙，產生一系列情感行為學方面的變化，稱為腦卒中后抑郁(post－stroke depression，PSD)。PSD是卒中后最常見和最嚴重的神經精神并發(fā)癥之一，約有1/3的腦卒中患者出現(xiàn)抑郁癥狀［1］，不但嚴重影響患者神經功能的康復，顯著降低患者的生活質量，而且死亡率高達非PSD患者的3～4倍［2］。因此，對PSD患者進行早期而有效的防治具有非常重要的現(xiàn)實和社會意義。抑郁癥的顯著特征之一是行為學的改變，其也是檢測實驗中抑郁動物模型成功與否的重要指標，本研究采用復合法制備腦卒中后抑郁大鼠模型，通過中藥補陽還五湯的干預，并用氟西汀作對照，分別在應激前和應激后7 d、14 d和21 d進行行為學測試，以期動態(tài)觀察補陽還五湯對腦卒中后大鼠行為學的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級雄性SD大鼠60只，體重(220～250)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號［SCXK(湘)2011－0005］。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級飼養(yǎng)間內，使用許可證號:［SYXK(湘)2008－0003］。

1.2 藥物與儀器

補陽還五湯處方組成:黃芪120 g，歸尾6 g，赤芍 4.5 g，紅花 3 g，川芎 3 g，桃仁 3 g，干地龍 3 g。藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學附屬一醫(yī)院門診藥房，藥劑水煎濾出藥渣濃縮成每毫升含生藥2 g，冷藏待用;鹽酸氟西汀膠囊:禮來蘇州制藥有限公司，藥品批號:國藥準字J20080016。SMART2.5系統(tǒng)及立柱體曠場箱設備(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，WD－9405B型水平搖床(北京市六一儀器廠)，穿梭箱(西班牙Panlab公司)。

1.3 分組與給藥

大鼠適應性飼養(yǎng)1周，1周后測曠場試驗(openfield test，OFT)基線值，選擇評分相近的大鼠60只隨機分為:假手術組、卒中組、PSD組、補陽還五湯組、氟西汀組，共5組，每組12只。假手術組、卒中組每籠飼養(yǎng)6只，其余各組每籠飼養(yǎng)1只。給藥時間為21 d，從應激后第1天開始，每天灌胃1次，每周測體重1次，根據(jù)體重變化更新劑量。補陽還五湯組每日灌胃1次，用量為13.26 mg/kg補陽還五湯藥液(按體表面積計算相當60 kg成人用量的3倍);氟西汀組予氟西汀溶液每日等容積混懸液灌胃1次，用量為1.54 mg/kg;余下各組均每日等容積灌胃蒸餾水10 mL/kg灌胃。

1.4 模型制備

采用大腦中動脈栓塞法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備腦缺血大鼠模型，并在此基礎上，給予孤養(yǎng)和慢性不可預知的溫和應激法(chronic unpredictable mild stress，CUMS)聯(lián)合制備PSD模型。腦缺血大鼠模型:參照 Zea－Longa文獻［3］制備右側大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠模型，動物術后參照Bederson［4］的5分制法對術后清醒大鼠進行神經功能評分，分值在l～3分者入組，死亡不足動物再隨機補充。假手術組動物，除在手術過程中不插入錢栓以外，其他的過程相同。⑵CUMS模型:術后參照文獻［5］方法略加改進:①禁食禁水21 h;②行為限制30 min;③45°傾斜鼠籠24 h;④晝夜顛倒24 h;⑤水平搖晃5 min;⑥濕籠(100 g鋸屑加200 mL水)24 h;⑦聲電刺激(電壓0.9mA)8次/只等7種。每天隨機選取一種應激，相同應激不連續(xù)出現(xiàn)，每種應激出現(xiàn)3次共21 d。假手術組除每天抓取1次外，不做其他處理。⑶孤養(yǎng):大鼠單籠飼養(yǎng)。

1.5 行為學檢測

1.5.1 體重檢測:在術前1d和 CUMS后第7、14、21天對各組大鼠進行體重測量。

1.5.2 神經功能評分:除假性手術組外，其余各組于CUMS后第 7、14、21天運用 Ayelet Levy評分法［6］評價各組大鼠不同時間點神經功能恢復情況。評分:(1)提住尾巴將小鼠逐漸提高:前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，30s內頭移動與縱軸形成角度＞10°1分;(2)將小鼠置于地面:正常爬行0分，無法直線爬行1分，沿患側轉圈2分，患側跌倒3分;(3)梁平衡測試:靜態(tài)姿勢下可平衡0分，抓握梁邊1分，抱住梁，有一肢體掉落2分，抱住梁，有兩肢體掉落，或在梁上旋轉(＞60s)3分，試圖在梁上保持平衡，但跌落(＞40 s)4分，試圖在梁上保持平衡，但跌落(＞20s)5分，跌落，但沒有試圖保持平衡或抓握梁(＜20s)6分;(4)反射缺失或異常動作:耳廓反射(當觸耳道時搖頭)1分，角膜反射(用棉花絲輕觸角膜時眨眼)1分。因此，分數(shù)越高，損傷程度越重。

1.5.3 蔗糖水消耗實驗［7］:于術前 1 d和 CUMS后第7、14、21天對各組大鼠進行糖水消耗試驗。實驗前訓練大鼠飲用l%蔗糖水，即在每個鼠籠放置2個水瓶，在開始的24 h內兩瓶均裝有1%蔗糖水，隨后第2個24 h內1個瓶裝純凈水，另1個瓶裝1%蔗糖水。進行試驗測定時大鼠禁食禁水20 h，然后給予每只測試大鼠一瓶1%蔗糖水和一瓶純凈水，1 h后取瓶測量計算動物的糖水飲用比率(糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。

1.5.4 曠場實驗［8］:于術前 1 d 和 CUMS 后第 21天進行礦場實驗。采用立柱體曠場箱，規(guī)格(100×100×40)cm，周壁、底面為黑色。將大鼠置于曠場箱底面的中心，用SMART實時視頻圖像跟蹤分析系統(tǒng)記錄大鼠在3 min內的移動距離(travelled distance，Dist)、平均速度(不包含休息時間)(speedaverage(without resting time)，V.Avge)。測試時在光線昏暗、安靜的環(huán)境下進行，每次測定結束后清除干凈動物的排泄物，每只只測定1次，實驗時間結束后通過錄像分析軟件統(tǒng)計結果。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計均以P＜0.05作為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時期體重比較

由表1結果可見，術后應激第7天起PSD組、卒中組較假手術組體重增幅減慢(P＜0.05或P＜0.01)，且PSD組體重降低更明顯;應激第14 d、21 d卒中組體重增長逐漸恢復正常，而PSD組體重增幅明顯減慢(P＜0.01);補陽還五湯干預后在應激第7天與PSD組相比體重增加(P＜0.05)，第14、21天體重增加明顯高于PSD組(P＜0.01)，氟西汀和補陽還五湯組之間差異無統(tǒng)計學意義，說明補陽還五湯及氟西汀能改善卒中后抑郁大鼠模型的抑郁狀態(tài)，增加大鼠體重。

2.2 神經功能評分比較

由表2結果可見，通過Ayelet Levy評分法檢測，各組大鼠在術后均出現(xiàn)了程度不等的神經功能缺損，術后應激第7天神經功能評分比較各組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);隨后PSD組大鼠神經功能評分逐漸增加，第14、21天與卒中組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或 P＜0.01);治療組氟西汀和補陽還五湯組其神經功能評分逐漸降低，且與PSD組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05或P＜0.01)，表明其均促進其神經功能恢復，但氟西汀組和補陽還五湯組比較差異無統(tǒng)計學(P＞0.05)。

表1 各組大鼠不同時間點體重比較(n=10，±s，g)Tab.1 Comparison of the body weight of rats in each group at different time－points(n=10，±s，g)

表1 各組大鼠不同時間點體重比較(n=10，±s，g)Tab.1 Comparison of the body weight of rats in each group at different time－points(n=10，±s，g)

注:與假性手術組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與卒中組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與 PSD 比較，﹡P ＜0.05，﹡﹡P ＜0.01。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，﹡P ＜0.05，﹡﹡P ＜0.01.

應激第21天Stress，21 days假性手術組 Sham operation group 250.90 ±18.30 285.55 ±18.04 310.58 ±22.77 333.66 ±25.05卒中組 Stroke group 258.63 ±16.33 266.35 ±17.19# 288.58 ±20.05 309.69 ±21.28 PSD 組 PSD group 260.82 ±17.90 250.44 ±16.82## 263.80 ±14.87##△ 277.09 ±14.77##△氟西汀組 Fluoxetine group 257.07 ±17.75 267.03 ±18.60 288.00 ±23.29* 309.81 ±22.50*補陽還五湯組 Chinese medicine group 260.66 ±20.02 278.81 ±18.09* 308.38 ±19.27＊＊ 329.09 ±20.69組別Groups 應激前Before stress應激第7天Stress，7 days應激第14天Stress，14 days＊＊

表2 各組大鼠神經功能評分比較(n=10，±s)Tab.2 Comparisons of neurological score in the rats of each group(n=10，±s)

表2 各組大鼠神經功能評分比較(n=10，±s)Tab.2 Comparisons of neurological score in the rats of each group(n=10，±s)

注:與卒中組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01;與 PSD比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note.Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

應激第14天Stress，14 days組別Group 應激第7天Stress，7 days Chinese medicine group應激第21天Stress，21 days假性手術組 Sham operation group 7.83 ±1.66 6.40 ±1.50 5.10 ±1.62卒中組 Stroke group 8.27 ±1.45 8.98 ±1.76△ 9.22 ±1.59△△PSD 組 PSD group 6.73 ±1.70 5.44 ±1.51* 3.86 ±1.73＊＊氟西汀組 Fluoxetine group 6.55 ±1.83 4.30 ±1.80△＊＊ 2.91 ±1.63△＊＊補陽還五湯組

2.3 蔗糖水消耗實驗

由表3結果可見，造模前各組大鼠飲用糖水消耗比例無明顯差異(P＞0.05);從術后應激第7天起PSD模型組糖水消耗率呈下降趨勢，且與假手術組、卒中組有顯著性差異(P ＜0.05或P ＜0.01);給予藥物干預后，氟西汀組在應激14 d、21 d糖水消耗率有所上升，與PSD組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而補陽還五湯組在應激第7天與PSD模型組比較就明顯增加了糖水消耗率(P＜0.05)，說明在一定階段其療效優(yōu)于氟西汀，補陽還五湯組在應激14 d、21 d與PSD組比較均可明顯增加糖水消耗率(P ＜0.01)。

2.4 曠場實驗

由表4結果可見，術后應激21 d后，PSD組大鼠運動總路程顯著縮短，運動平均速度明顯減低，與卒中組、假性手術組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05或P ＜0.01);通過補陽還五湯干預治療后運動總路程明顯增加、運動平均速度也明顯加快，與PSD組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05或P ＜0.01);而補陽還五湯組與氟西汀組在運動總路程和平均速度上差異均無統(tǒng)計學(P＞0.05)。說明補陽還五湯和氟西汀均可增加卒中后抑郁大鼠移動距離和平均速度。

表3 各組大鼠不同時間點糖水消耗率比較(n=10，±s，%)Tab.3 Comparisons of sugar consumption in the rats of each group at different time－points(n=10，±s，%)

表3 各組大鼠不同時間點糖水消耗率比較(n=10，±s，%)Tab.3 Comparisons of sugar consumption in the rats of each group at different time－points(n=10，±s，%)

注:與假性手術組比較，#P ＜0.05##P ＜0.01;與卒中組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與 PSD 比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與氟西汀比較:☆P＜0.05。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with the fluoxetine group，☆P ＜0.05.

應激第21天Stress，21 days假性手術組 Sham operation group 81.62 ±8.02 77.05 ±5.63 81.44 ±9.04 83.28 ±7.40卒中組 Stroke group 80.06 ±6.22 78.87 ±8.04 80.62 ±6.64 82.63 ±5.55 PSD 組 PSD group 80.93 ±5.58 68.04 ±5.46#△ 54.33 ±8.22##△△ 42.70 ±7.71##△△氟西汀組 Fluoxetine group 78.80 ±7.25 69.22 ±5.80#△ 76.62 ±5.08＊＊ 79.33 ±4.66＊＊補陽還五湯組 Chinese medicine group 77.75±7.80 76.94±4.48＊☆ 79.01±6.62＊＊ 81.71±7.04組別Group 應激前Before stress應激第7天Stress，7 days應激第14天Stress，14 days＊＊

表4 各組大鼠曠場實驗測定結果比較(n=10，±s)Tab.4 Comparison of open－field test results in the rats of each group(n=10，±s)

表4 各組大鼠曠場實驗測定結果比較(n=10，±s)Tab.4 Comparison of open－field test results in the rats of each group(n=10，±s)

注:與假性手術組比較，#P ＜0.05##P ＜0.01;與卒中組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與 PSD 比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note.Compared with the sham operation group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with the cerebral ischemic stroke group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;Compared with the PSD group，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

造模前Before modeling組別Groups應激后After stress造模前Before modeling應激后After stress假性手術組Sham operation group 1246.20 ±145.78 1503.08 ±282.60 13.08 ±3.65 12.77 ±2.28卒中組 Stroke group 1333.09 ±212.62 1498.24 ±352.64 12.69 ±4.24 10.46 ±3.83 PSD 組 PSD group 1378.75 ±268.08 838.57 ±265.50##△△ 12.04 ±2.66 6.05 ±4.09#△氟西汀組 Fluoxetine group 1447.78 ±303.66 1315.66 ±312.21＊＊ 10.91 ±4.09 10.88 ±2.45*補陽還五湯組 Chinese medicinegroup 1293.34 ±255.07 1499.32 ±277.42＊＊ 11.57 ±2.88 12.63 ±2.66*

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，PSD是以精神和軀體癥狀相結合的復雜的神經精神情感障礙性疾病，它是各種神經生物學和社會心理因素綜合作用的結果，其發(fā)病符合生物－心理－社會醫(yī)學模式，即PSD的發(fā)生既是卒中后出現(xiàn)了顱內特定部位損傷的直接結果，又是卒中這一突發(fā)應激事件給患者帶來各種心理反應及社會因素影響的結果［9］。中醫(yī)學辨證認為，PSD屬于“郁證”范疇，因其發(fā)生在中風之后，又將其歸為中風與郁證之合病，屬于“因病致郁”;卒中后氣虛血瘀、血瘀阻絡為其病機核心，又因肢體偏癱等因素思慮過度，情志不舒，傷及肝脾二臟為其發(fā)病的最重要原因［10］。因此目前多數(shù)醫(yī)家認為本病病位在腦，涉及肝、脾、腎等，其證屬本虛標實或虛實夾雜，病之本屬精氣血虧虛，病之標則為痰瘀互結［11］，故治療上基于急則治標、緩則治本的原則，在辨證論治原有疾病的基礎上，以補氣活血通絡為治其本。本實驗所選補陽還五湯是補氣行瘀、疏通經絡的代表方劑，是治療中風后遺癥的經典名方，方中當歸、川芎、赤芍、桃仁、紅花活血化瘀，地龍通經活絡，并重用黃芪大補元氣，使全方具有補氣而不留邪，活血而不傷正之功效［12］。

本實驗首先通過線栓法制備腦缺血卒中模型造成大鼠腦血管急性病理損傷，再運用孤養(yǎng)法及慢性不可預知的溫和應激法聯(lián)合模擬恢復期負性壓力環(huán)境制備PSD模型大鼠，目前該模型廣泛應用于PSD形成機制和藥物療效評價的研究［13］。對于PSD大鼠的顯著特征之一—行為學的觀察，其體重變化、糖水消耗實驗和曠場實驗是反映動物抑郁癥狀和軀體癥狀的關鍵指標，因此本研究用以上三個重要指標來綜合評價補陽還五湯對PSD大鼠的干預作用。

臨床上抑郁癥病人通常會出現(xiàn)食欲下降、體重減輕現(xiàn)象，所以體重的變化是衡量PSD大鼠的量化指標之一。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在應激刺激第7d、14d、21dPSD組大鼠體重增幅明顯減慢，與假手術組比較有顯著性差異，而卒中組在第14d后體重增幅逐漸恢復正常，提示應激事件影響到了動物體重的增長;給予藥物干預的氟西汀組和補陽還五湯組，均能明顯改善PSD大鼠體重增長情況，提示中藥補陽還五湯干預對促進食物的吸收有一定促進作用，可以緩解動物因應激事件引起的體重增幅減慢的現(xiàn)象。

興趣缺乏、快感缺失是CUMS模型動物抑郁行為中最為核心的癥狀之一，嚙齒類動物快感缺失的定量評價方法主要為糖水消耗實驗［14］。本實驗研究結果顯示，基于嚙齒類動物喜好糖水的天性，經過應激處理的PSD組大鼠的糖水消耗量明顯較假手術組和卒中組大鼠下降，表明PSD大鼠對獎賞機制的敏感性減低，出現(xiàn)了明顯的抑郁癥狀。而通過氟西汀、補陽還五湯藥物干預的大鼠糖水消耗量明顯增加，且補陽還五湯組在應激第7天與PSD組比較就明顯增加了糖水消耗率，說明在一定階段其療效優(yōu)于氟西汀，提示補陽還五湯能增加PSD大鼠對獎賞機制的敏感性，減輕其抑郁癥狀。

曠場實驗由Hall在1934年提出，用于觀察動物在特定陌生環(huán)境一定時間內中的自發(fā)活動行為，是反應大鼠對未知環(huán)境的探索能力及情緒反應的經典實驗。本實驗采用小動物視頻圖像跟蹤分析系統(tǒng)，動態(tài)分析大鼠在曠場箱中的活動軌跡，

以運動總路程和平均速度等為觀察指標，能更直接地反應動物的抑郁程度，從而避免了傳統(tǒng)的人為觀察記錄動物的跨格次數(shù)所造成標準不一致性、主觀性程度大以及費時費力等缺點，取得更加真實準確的實驗數(shù)據(jù)［15］。實驗結果顯示，通過21d的應激刺激后，PSD組大鼠總路程顯著縮短，運動平均速度明顯減低，與卒中組、假性手術組比較有統(tǒng)計學差異，說明動物對未知環(huán)境出現(xiàn)了興奮性和探索能力降低等癥狀，與抑郁癥狀具有一定相似性。而給予干預治療后運動總路程明顯增加、運動平均速度也明顯加快，提示補陽還五湯干預可以改善PSD大鼠的探索性活動，緩解抑郁癥狀。

以往研究表明腦卒中后抑郁的發(fā)生與腦卒中的亞型無關，而與腦卒中后的神經功能損傷程度有關，神經功能的恢復有助于腦卒中后抑郁癥狀的緩解［16－17］。本實驗結果也顯示，應激 14d、21d 后 PSD組大鼠神經功能評分逐漸增加，神經功能損傷加劇，與卒中組比較有統(tǒng)計學差異。而給與藥物干預后，神經功能恢復良好。

綜上所述，本文對卒中后抑郁大鼠的行為學變化進行了初步探討，顯示補陽還五湯具有一定的治療PSD的效果，不但減輕了PSD大鼠的抑郁程度，而且對卒中引起的神經功能缺損有良好的恢復作用，充分發(fā)揮了中藥多靶點、多效應的作用，但其具體的作用機制還有待今后從顯微形態(tài)學、分子生物學等方面進行深入的探究。

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