食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定

龐榮清，何 潔，李瑞生，趙 晶，朱 慧，3，朱向情，阮光萍，潘興華

（1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；3.昆明醫(yī)科大學(xué)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院，昆明 650031）

食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定

龐榮清1，何 潔1，李瑞生2，趙 晶1，朱 慧1，3，朱向情1，阮光萍1，潘興華1

（1.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院云南省干細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650032；2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039；3.昆明醫(yī)科大學(xué)昆明總醫(yī)院臨床學(xué)院，昆明 650031）

目的建立食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。方法 新鮮食蟹猴臍帶剪碎為糊狀，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)特征，流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞抗原標(biāo)志的表達(dá)，并檢測(cè)其體外多向分化潛能。結(jié)果 運(yùn)用組織貼塊法可以從新鮮臍帶中分離到貼壁生長(zhǎng)、陽(yáng)性表達(dá)CD29、CD44、CD90的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。這些細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后可分別檢測(cè)到脂滴、骨和軟骨細(xì)胞。結(jié)論 運(yùn)用組織貼塊培養(yǎng)法可用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液從食蟹猴臍帶中分離到間充質(zhì)干細(xì)胞。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；食蟹猴；培養(yǎng)方法

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是目前研究最多的種子細(xì)胞之一，在再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究方面具有廣闊的應(yīng)用前景［1］。食蟹猴是醫(yī)學(xué)研究常用的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［2］，雖然國(guó)內(nèi)已建立了食蟹猴骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（cynomolgus monkeybonemarrow mesenchymal stem cells，cBMMSC）的分離培養(yǎng)方法［3］，推動(dòng)了食蟹猴在再生醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用［4］，但骨髓采集數(shù)量較少，短期內(nèi)很難大量擴(kuò)增cBMMSC，且cBMMSC活性容易受到供體年齡的限制［3，5］。目前尚未見食蟹猴臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells，cUCMSC）分離培養(yǎng)的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)室在前期工作［6］的基礎(chǔ)上，試圖建立cUCMSC的分離培養(yǎng)方法，以滿足以食蟹猴為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大規(guī)模開展再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究的需要。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和trypsin-EDTA均購(gòu)自Invitrogen公司；FITC標(biāo)記的抗猴流式單抗 CD29、CD34、CD44、CD90購(gòu)自NeoMarkers公司；成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

手術(shù)環(huán)境條件下，剖宮產(chǎn)取足月食蟹猴胎猴臍帶，送至無(wú)菌實(shí)驗(yàn)條件下參照我們建立的方法［6］分離培養(yǎng)cUCMSC。即用雙抗液沖洗臍帶，然后將其在離心管內(nèi)剪碎為糊狀，加入少許含有10％FBS的DMEM/F12并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，于5％CO2、37℃的條件下靜置培養(yǎng)，適時(shí)換液。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性及形態(tài)特征。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，用 trypsin-EDTA消化傳代細(xì)胞。

1.3 流式細(xì)胞分析

參照我們建立的方法［6］收集生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞，加入流式抗體CD29、CD34、CD44、CD90室溫條件下避光孵育30 min，漂洗棄除未結(jié)合抗體后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗原標(biāo)志的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞分化潛能的鑒定

參照本實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，依據(jù)試劑盒說明書推薦的方法和實(shí)驗(yàn)濃度進(jìn)行，即收集生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞完成體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)［6］。成脂分化：接種細(xì)胞（4×104/孔）于12孔板中培養(yǎng)6 h后，更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，3至4天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4％多聚甲醛固定后加入油紅O染色；成骨分化：按照上述成脂分化培養(yǎng)細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21天后，固定并加入茜素紅染色；成軟骨分化：收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1.6×107/mL，每孔加5 μL到12孔板的中心，形成一個(gè)細(xì)胞滴，2 h后再緩慢加入成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，2至3天換液一次，隨著培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)形成一個(gè)細(xì)胞團(tuán)漂浮起來(lái)，連續(xù)培養(yǎng)14 d后，4％多聚甲醛固定后石蠟包埋作病理切片，脫蠟后加入阿新藍(lán)染色。

2 結(jié)果

2.1UCMSC的形態(tài)特征

從健康足月的剖宮產(chǎn)胎猴，可以一次獲得約5 cm長(zhǎng)的臍帶，將其剪碎后采用貼壁培養(yǎng)的方法，在少許含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)5 d，即可在倒置相差顯微鏡下觀察到少數(shù)梭形貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，或見到組織塊周圍長(zhǎng)出的貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。這些細(xì)胞傳代后可快速密集排列呈漩渦狀生長(zhǎng)，顯示與cBMMSC類似的生長(zhǎng)特征（圖1，見彩插），初步判斷這些貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞就是cUCMSC。

2.2 細(xì)胞免疫表型分析

生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示cUCMSC表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特異性抗原標(biāo)志而不表達(dá)造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志。造血干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記CD34為陰性（圖2A），而CD29，CD90，CD44均陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率均在95％以上（圖2B、2C、2D）。

2.3 分化潛能鑒定

體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)顯示：第三代細(xì)胞經(jīng)成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，固定并行病理切片檢測(cè)，可觀察到大量氨基葡聚糖被阿新蘭染成藍(lán)色（圖3A，A1），即成軟骨分化陽(yáng)性。同樣，成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，可觀察到大量脂滴的出現(xiàn)，油紅O染色后，可見脂滴被染成紅色（圖3B，B1），即成脂分化陽(yáng)性；成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，可觀察到白色結(jié)節(jié)，茜素紅染色后，可見鈣質(zhì)結(jié)節(jié)被染成紅色（圖3C，C1），即成骨分化陽(yáng)性（圖3見封三）。

3 討論

猴與人類基因組相似程度高達(dá)95％，是開展人類臨床前研究的珍貴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。食蟹猴具有體型小，飼養(yǎng)成本低，性情溫順，便于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被越來(lái)越多地用于藥物安全性評(píng)價(jià)等生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［2］。隨著干細(xì)胞應(yīng)用基礎(chǔ)研究不斷取得進(jìn)展，迫切需要使用非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛開展干細(xì)胞臨床應(yīng)用安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究。臍帶是連接胎兒與胎盤的索狀結(jié)構(gòu)組織，是胎兒與母體物質(zhì)交換的主要通道。利用臍帶來(lái)分離擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，取材十分方便，可一次性獲得較多組織而在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增出足夠數(shù)量的細(xì)胞；其次，臍帶屬于胎兒組織的一部分，含有胚胎發(fā)育過程中遺留的大量原始細(xì)胞，從臍帶組織中可以分離獲得增殖分化能力強(qiáng)的原始干細(xì)胞，不像BMMSC那樣容易受到供體年齡的限制［5，7］；此外，由于胎盤屏障的存在，使得臍帶受到各種病原微生物感染的機(jī)會(huì)較低。因此，臍帶是獲取間充質(zhì)干細(xì)胞的重要組織來(lái)源。

圖2 cUCMSC的免疫表型分析Note：A.Negative expression of CD34；B.Positive expression of CD29；C.Positive expression of CD44；D.Positive expression of CD90.Fig.2 Immunophenotype analysis of the cUCMSC

本研究結(jié)果表明：一只健康足月剖宮產(chǎn)胎猴，一次可以獲得5 cm長(zhǎng)的臍帶，剪碎后采用貼壁培養(yǎng)方法，可以分離到大量貼壁生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，流式分析結(jié)果顯示這些細(xì)胞高表達(dá) CD29、CD44、CD90，體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些細(xì)胞可以分化為脂肪、骨和軟骨細(xì)胞，這些結(jié)果與任振華等報(bào)道的結(jié)果［3］一致。根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)［8］，可以判定這些貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞就是cUCMSC。從這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：一次獲得5 cm長(zhǎng)的食蟹猴臍帶組織，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過骨髓采集途徑獲得的組織數(shù)量，在短期內(nèi)可以擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的干細(xì)胞，相對(duì)于cBMMSC而言，這是cUCMSC最大的優(yōu)勢(shì)所在。比如在干細(xì)胞靜脈輸注治療安全評(píng)價(jià)等實(shí)驗(yàn)研究［9］中，需要在5周之內(nèi)為1只體重5 kg的食蟹猴準(zhǔn)備5×107的干細(xì)胞，這對(duì)干細(xì)胞安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)提出了很高的要求，如果采用本研究建立的cUCMSC分離培養(yǎng)方法，很容易達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。其次，cUCMSC不像cBMMSC那樣容易受到供體年齡的限制［3，5］，臍帶組織含有胚胎發(fā)育過程中遺留的大量原始干細(xì)胞、通過分離擴(kuò)增可以獲得Oct-4、Nanog等抗原標(biāo)志陽(yáng)性的多潛能干細(xì)胞已經(jīng)得到研究證實(shí)［10-12］，這些Oct-4、Nanog陽(yáng)性的干細(xì)胞具有更大的分化潛能，被認(rèn)為是組織修復(fù)治療真正的干細(xì)胞［13］。

綜上所述，本研究證明了cUCMSC是開展再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究更理想種子細(xì)胞，同時(shí)本研究建立的cUCMSC分離培養(yǎng)方法容易規(guī)?；a(chǎn)，我們已經(jīng)成功建立了cUCMSC資源庫(kù)，可供國(guó)內(nèi)外開展以食蟹猴為研究背景的科技工作者使用研究。

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Isolation and identification of cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells

PANG Rong-qing1，HE Jie1，LI Rui-sheng2，ZHAO Jing1，ZHU Hui1，3，ZHU Xiang-qing1，RUAN Guang-ping1，PAN Xing-hua1
（1.Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province，Kunming General Hospital of PLA Chengdu Military Command，Kunming 650032，China；2.Experimental Research Support Center，302 Hospital of PLA，Beijing 100039；3.Clinical Institute of Kunming Medical University，Kunming 650031）

Objective To establish a method for isolation of cynomolgus monkey umbilical cord mesenchymal stem cells.Methods Fresh cynomolgus monkey umbilical cord was directly minced into pasty fine pieces，and the pieces were cultured in tissue flask with DMEM/F12 medium supplemented with 10％ fetal bovine serum.The morphological characteristics of the resulting cells were examined，and their expression of mesenchymal cell surface markers were analyzed by flow cytometry.The multidifferentiation potential was examined in vitro，too.Results The fibroblast-like cells were successfully isolated from the fresh umbilical cord by an adherent culture procedure.These adherent cells expressed mesenchymal markers including CD29，CD44，and CD90，and also could be induced to differentiate into adipocytes，osteoblasts and chondrocytes.Conclusion Mesenchymal stem cells can be isolated from fresh cynomolgus monkey umbilical cord by using an adherent culture procedure.

Umbilical cord；Mesenchymal stem cells；Cynomolgus monkey；Cell culture

李瑞生（1969-），男，博士，副研究員，E-mail：lrsheng@sohu.com；潘興華（1963-），男，博士，主任醫(yī)師，E-mail：xinghuapang @aliyun.com。

R33

A

1671-7856（2015）04-0066-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.013

云南省自然基金項(xiàng)目（2011HB050，2013DA004）。

龐榮清（1971-），男，E-mail：pangrq2000@aliyun.com。

2015-02-05

綜述與專論