救腦益智方劑水提液對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

張景燕，張靜爽，曹子青，趙志煒，張 旭，吳燕川，王玉蘭，王 蓉

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053；2.北京京師中醫(yī)醫(yī)院，北京 100026）

救腦益智方劑水提液對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

張景燕1，張靜爽1，曹子青2，趙志煒1，張 旭1，吳燕川1，王玉蘭1，王 蓉1

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053；2.北京京師中醫(yī)醫(yī)院，北京 100026）

目的通過(guò)觀察復(fù)方中藥救腦益智方劑水提液對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)以及胰島素信號(hào)通路的影響，探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，分為對(duì)照組（C組）、救腦益智1號(hào)方組和3號(hào)方組，每組藥物劑量分別為0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，測(cè)定各組細(xì)胞的噻唑藍(lán)（MTT）代謝率，選定0.125 mg/mL進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，觀察細(xì)胞形態(tài)和胰島素受體底物-1（IRS-1）、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）表達(dá)的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，救腦益智組MTT代謝率升高（P＜0.05），細(xì)胞形態(tài)好，表現(xiàn)為細(xì)胞胞體飽滿、貼壁良好、突起延長(zhǎng)，IRS-1和CREB表達(dá)增加。結(jié)論 復(fù)方中藥救腦益智水提液能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，提高神經(jīng)元胰島素信號(hào)通路相關(guān)因子IRS-1和CREB表達(dá)，推測(cè)其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與胰島素信號(hào)通路有關(guān)。

阿爾茨海默病；復(fù)方中藥，救腦益智方劑；人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD，又稱老年性癡呆）是以認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)的、漸進(jìn)性加重的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，臨床上80％以上的患者屬于病因不清、發(fā)病機(jī)制不明的散發(fā)性AD，由于缺乏有效的早期診斷和治療措施，AD已經(jīng)成為繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后威脅人類(lèi)健康的第四大殺手［1-3］。AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，近年來(lái)，腦內(nèi)神經(jīng)元胰島素信號(hào)通路障礙在AD發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越引起學(xué)者們的關(guān)注［4-6］。

救腦益智膠囊的主要成分有生黃芪、黨參、白術(shù)、龜甲、穿山甲、肉蓯蓉等，具有益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、化痰祛痕、健腦益智功效，在臨床上對(duì)一些腦萎縮病人有較好的治療作用［7］。以往研究發(fā)現(xiàn)救腦益智膠囊能促進(jìn)神經(jīng)元胞體增大和突起延長(zhǎng)［8］，并能促進(jìn)SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞存活信號(hào)通路中Akt/PKB，P-CREB的表達(dá)［9］。本研究擬通過(guò)觀察救腦益智膠囊的改良配方（1號(hào)方和3號(hào)方）方劑水提液對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)以及胰島素信號(hào)通路的影響，探討其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)自瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院。

1.1.2 藥品與試劑：救腦益智水提液由救腦益智膠囊制成（膠囊主要成分包括黃芪、黨參、肉蓯蓉、龜板、當(dāng)歸、白芍等20余味中草藥，形態(tài)為粉劑，使用前用電子天平稱重，然后加蒸餾水煮沸15 min，離心取出上清液，再向沉淀物中加入蒸餾水煮沸15 min，離心取上清液，將兩次取出的上清液混合，濃度調(diào)整為1 g生藥/3 mL，即若蒸餾100 g生藥將得到300 mL水提 液）。MTT（噻 唑 藍(lán)，3-［4，5-dimethylthylthiazol-2-yl］-2，5diphenyltetrazolium broide）系Sigma產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）系北京亞太精細(xì)化工公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液1次，6 d傳代1次。

1.2.2 測(cè)定MTT代謝率：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好、傳代穩(wěn)定的SH-SY5Y細(xì)胞以1×104/mL的密度接種于96孔板（Nunc產(chǎn)品）中，每孔各加200 μL，培養(yǎng)48 h后分為3組：對(duì)照組、救腦益智1號(hào)方組（主要成分包括黃芪、黨參、補(bǔ)骨脂等）和3號(hào)方組（主要成分包括人參、益智仁、鹿角等），進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各藥物組所加相應(yīng)藥物的濃度分別為 0.0625 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL，各組培養(yǎng)液體積和接種細(xì)胞數(shù)相等。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加MTT溶液（5 mg/mL）20 μL/孔，于37℃孵育4 h后吸出培養(yǎng)液，再加DMSO溶液200 μL/孔，振搖 10min后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Multiskan Spectrum）測(cè)定550 nm處吸光度值（A）。

1.2.3 細(xì)胞免疫熒光染色：將SH-SY5Y細(xì)胞以1× 104/mL的密度接種于24孔板中，每孔各加1 mL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后分為以上3組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)MTT結(jié)果選用0.125 mg/mL藥物劑量作用細(xì)胞24 h，然后吸棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗1次，加入4％多聚甲醛固定30 min，10％山羊血清封閉1 h，加入一抗（IRS-1抗體、CREB抗體，1：100）于4℃孵育過(guò)夜，用PBS漂洗后加相應(yīng)二抗（1：200）孵育1 h，PBS漂洗后于熒光倒置顯微鏡下觀察并采集影像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT代謝率測(cè)定

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，救腦益智1號(hào)方組和3號(hào)方組的SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率升高，線粒體活性增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 救腦益智1號(hào)方組和3號(hào)方組對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞MTT代謝率的影響Tab.1 Effect of Jiu Nao Yi Zhi No.1 or No.3 prescription on the metabolic rate in SH-SY5Y cells

2.2 細(xì)胞免疫熒光染色

從細(xì)胞形態(tài)上看，救腦益智1號(hào)方和3號(hào)方的細(xì)胞形態(tài)相對(duì)好，細(xì)胞胞體飽滿、貼壁良好、突起延長(zhǎng)；另外，與對(duì)照組相比，1號(hào)方和3號(hào)方的細(xì)胞中IRS-1和CREB表達(dá)增加。各組SH-SY5Y細(xì)胞的形態(tài)及CREB、IRS-1的表達(dá)情況分別見(jiàn)圖1、圖2（圖1，2見(jiàn)文后彩插5）。

3 討論

救腦益智膠囊的主要成分有生黃芪、黨參、白術(shù)、肉蓯蓉等，具有益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、化痰祛痕、健腦益智功效，可用于氣血肝腎虧虛、痰疲阻滯引起的健忘不寐，神情呆滯，眩暈耳鳴，言語(yǔ)蹇澀，肢體瘓軟，步履艱難等癥候者［7］。我們?cè)?jīng)研究發(fā)現(xiàn)，救腦益智提取液能促進(jìn)體外培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）生長(zhǎng)，推測(cè)其機(jī)理可能與其促進(jìn)神經(jīng)元信號(hào)通路中有關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)［9］，此后我們一直在研究與之相關(guān)的蛋白質(zhì)及其作用途徑。

本研究結(jié)果表明，救腦益智水提液能促進(jìn)SHSY5Y細(xì)胞胞體體積的增大和突起的延長(zhǎng)，并能提高M(jìn)TT代謝率。MTT是琥珀酸脫氫酶的作用底物，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使其還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。DMSO溶解細(xì)胞中的甲瓚，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。MTT值越大，代表活細(xì)胞數(shù)目越多。

眾所周知，神經(jīng)元可通過(guò)多條途徑使自身存活，而IRS-PI3K/Akt-BAD-CREB途徑即是其主要途徑之一，IRS磷酸化后激活PI3K/Akt，最終使CREB磷酸化，從而使神經(jīng)元存活。本室以往的研究結(jié)果表明救腦益智膠囊水提液能提高使SH-SY5Y細(xì)胞存活的PI3K信號(hào)通路中Akt和p-CREB的表達(dá)水平，而Akt表達(dá)增加可促進(jìn)CREB磷酸化增加，即與本室得出的研究結(jié)果p-CREB表達(dá)增加一致，而SY5Y細(xì)胞的存活一方面依賴于p-CREB表達(dá)水平的提高［9］。本研究結(jié)果表明，救腦益智方劑水提液也可使IRS-1、CREB表達(dá)增加，由此可以推斷救腦益智方劑水提液中含有某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)成分，而且可以通過(guò)影響胰島素信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)水平，而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞并促進(jìn)其生長(zhǎng)的作用。但是體外實(shí)驗(yàn)有效不等同于藥物在體內(nèi)也有效，因此仍需進(jìn)行充分的體內(nèi)試驗(yàn)。

［1］Kalaria RN，Maestre GE，Arizaga R，et al.Alzheimer’s disease and vascular dementia in developing countries：prevalence，management，and risk factors［J］.Lancet Neurol，2008，7（9）：812-826.

［2］Miller G.Epigenetics.A role for epigenetics in cognition［J］.Science，2010，329（5987）：27-31.

［3］Guo M，Gao L，Zhang G，et al.Prevalence of dementia and mild cognitive impairment in the elderly living in nursing and veteran care homes in Xi’an，China［J］.J Neurosci，2012，312（1）：39-44.

［4］De Felice FG.Alzheimer’s disease and insulin resistance：translating basic science into clinical applications［J］.J Clin Invest，2013，123（2）：531-539.

［5］Candeias E，Duarte AI，Carvalho C，et al.The impairment of insulin signaling in Alzheimer’s disease［J］.IUBMB Life，2012，64（12）：951-957.

［6］Giuffrida ML，Tomasello F，Caraci F，et al.Beta-amyloid monomer and insulin/IGF-1 signaling in Alzheimer’s disease［J］.Mol Neurobiol，2012，46（3）：605-613.

［7］曹潤(rùn)敏，王仁，曹子青.救腦益智膠囊治療腦萎縮臨床觀察［J］.北京中醫(yī)，2000，5：61.

［8］張景燕，孟艷，趙志煒，等.救腦益智膠囊對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SYSY生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，22：82-83.

［9］孟艷，張景燕，王蓉，等.救腦益智膠囊水提物對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SY5Y信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28（11）：1076-1077.

Protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line

ZHANG Jing-yan1，ZHANG Jing-shuang1，CAO Zi-qing2，ZHAO Zhi-wei1，ZHANG Xu1，WU Yan-chuan，1WANG Yu-lan1，WANG Rong1
（1.Central Laboratory，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education，Center of Alzheimer’s Disease，Beijing Institute for Brain Disorders，Beijing 100053，China；2.Beijing Municipal Chinese Medicine Hospital，Beijing 100026，China）

Objective To observe the protective effect of the traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi water extract，on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line，its effect on expression of insulin signal transduction pathway，and to explore the related mechanisms.Methods SH-SY5Y cells cultured in vitro，were divided into control group，Jiu Nao Yi Zhi No.1 prescription group and No.3 prescription group.The doses were 0.0625 mg/mL，0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL and 1 mg/mL.The thiazolyl blue（MTT）metabolic rate of each group was determined.The dose of 0.125 mg/mL was chosen for cell immunofluorescence analysis，and to observe the expression of insulin receptor substrates-1（IRS-1），cAMP response element binding protein（CREB），and the factors of insulin signal transduction pathway.Results Compared with the control group，MTT metabolic rates of the Jiu Nao Yi Zhi groups were significantly increased（P＜0.05），and the cell morphology was much better in those groups，cell body more plump，welladherent and neurite extensions were observed.The expressions of IRS-1 and CREB were higher than that in the control group.Conclusions The traditional Chinese medicine prescription Jiu Nao Yi Zhi water extract can protect neurons by promoting nerve cell growth，and improving the expression of IRS-1 and CREB，the factors of insulin signal transduction pathway.

Alzheimer’s disease；Traditional Chinese medicine prescription，Jiu Nao Yi Zhi；Human neuroblastoma，cell line SH-SY5Y；Neuroprotection

R33

A

1671-7856（2015）04-0058-03

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.011

北京市自然科學(xué)基金（7132044）；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目（2011-1001-02）；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（2009-3-64）。

張景燕，女，主管技師，研究方向：細(xì)胞生物學(xué)，E-mail：908436005@qq.com。

王蓉，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)元退行性變的發(fā)生機(jī)制和防治策略。E-mail：rong_wang72@aliyun.com。

2015-02-10