自發(fā)性高血壓幼鼠淋巴微循環(huán)自律運動特征

盛有明 孟凡星 趙永剛 王 冰 李愛玲 李宏偉 修瑞娟

高血壓作為一種危害嚴重的慢性非傳染性疾病，發(fā)病率高居心血管疾病之首［1］。由微血管、微淋巴管及其相關(guān)體液共同構(gòu)成的微循環(huán)體系是機體循環(huán)系統(tǒng)進行外周阻力與血壓調(diào)控、代謝物及信息交換、組織灌注調(diào)節(jié)等活動最主要、最直接的功能執(zhí)行單元［2，3］，微循環(huán)功能紊亂在高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用正受到越來越強烈的廣泛關(guān)注［4，5］。

微淋巴管在體液回流、輸出組織間隙中的大分子蛋白質(zhì)和顆粒物質(zhì)、調(diào)節(jié)組織間隙壓、發(fā)揮免疫功能、吸收乳糜顆粒中發(fā)揮著主要作用［6，7］。微淋巴管具有“泵”與“導管”的二重性［8，9］，特別是集合淋巴管的快速、大幅度自律運動是收集淋巴液、克服近心端阻力、推動淋巴液回流的主要動力來源［10］。持續(xù)主動地吸納組織液，并以淋巴液形式輸出，對于維持組織間隙的正常微環(huán)境至關(guān)重要［9］。而整個血管網(wǎng)絡也處在這一微環(huán)境之中。這種動態(tài)平衡一旦被打破，即會引起病理反應，如水腫的發(fā)生［8］，還可能影響到血管的調(diào)控功能。因此，在探討高血壓病理機制時，除了對血管自身開展研究外，亦有必要深入探索微淋巴管功能狀態(tài)與高血壓發(fā)生發(fā)展之間的潛在聯(lián)系。本課題組前期研究［11］表明，8周齡和13周齡成年自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腸系膜集合淋巴管自律運動的收縮分數(shù)和收縮活性指數(shù)與對照組相比表現(xiàn)出不同程度地下降，提示持續(xù)高血壓可致淋巴微循環(huán)功能紊亂。本文報道自發(fā)性高血壓初期（3周齡）幼鼠淋巴微循環(huán)自律運動特征，旨在闡明高血壓不同發(fā)展階段的微淋巴管自律運動變化對高血壓發(fā)病機制的作用。

本文選擇的有關(guān)定量評價自律運動特征的指標能夠直觀地表現(xiàn)病理、生理條件下淋巴微循環(huán)的功能狀態(tài)［12－14］?；诟咚贁?shù)字圖像處理的自動化識別跟蹤測量技術(shù)是當前對微循環(huán)自律運動進行動態(tài)監(jiān)測最準確有效的手段［15，16］，因而實驗數(shù)據(jù)的可重復性和可信度均高，可以為不同發(fā)展階段SHR腸系膜集合淋巴管自律運動功能狀態(tài)研究提供可靠的技術(shù)方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級雄性3周齡SHR（SHR組，n＝11，平均壓130.8±10.7mmHg）和對照 Wistar大鼠 （Wistar組，n＝11，平均壓111.2±13.3mmHg）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2012－0001。兩組大鼠血壓差異有統(tǒng)計學意義（t＝－3.56，P＜0.05）。適應性飼養(yǎng)2天后進行實驗，SHR組與Wistar組逐只交叉進行。

1.2 腸系膜集合淋巴管活體觀察方法

腹腔注射3%戊巴比妥鈉（3mg／100g）麻醉。左側(cè)頸動脈插管并連接生理記錄儀（MP－150，BⅠOPAC，美國）測量血壓。按照 Xiu等［17］的方法手術(shù)暴露腸系膜集合淋巴管后置于裝有攝像頭（KY－100，JⅤC， 日 本）的 活 體 顯 微 鏡 （ACM，ZEⅠSS，德國）觀察平臺上，采用37.5℃±0.2℃恒溫、pH 7.4±0.2的林格氏液持續(xù)灌流。靜息30min后進行自律運動的觀察。

1.3 自律運動視頻錄像、動態(tài)跟蹤測量

選擇持續(xù)自律運動的集合淋巴管區(qū)段進行連續(xù)錄像。必要時追加麻醉。所錄視頻以XⅤⅠD編碼器編碼后保存為AⅤⅠ格式文件，供回放觀察和測量分析。24位真彩色視頻圖像分辨率為720×576像素，RGB三通道，每通道256級灰度，PAL制式標準幀率25幀／s。使用基于改良的塊匹配相關(guān)算法的ⅤasTrack技術(shù)［16］對視頻中集合淋巴管目標位點的管徑動態(tài)變化進行連續(xù)跟蹤測量。處于自律運動狀態(tài)的淋巴管管徑變化表現(xiàn)為管徑沿時間軸方向的類周期性波形圖（圖1）。各例隨機選取其中15個連續(xù)完整的收縮／舒張循環(huán)（即一次自律運動）波形進行統(tǒng)計。依次計算單次自律運動過程的特征指標。

圖1 包含6次收縮／舒張循環(huán)的自律運動跟蹤測量結(jié)果局部波形示例圖

1.4 自律運動特征參數(shù)計算方法

各項特征指標的計算參見圖2及下述公式：（1）基本特征指標：相對振幅（RA＝ 收縮振幅／收縮前靜息期管徑）、收縮頻率（Freq＝每分鐘所完成的收縮循環(huán)的次數(shù)）；（2）運動力學特征指標：收縮振幅（As）、舒張振幅（AD）、收縮時長（Ts）、舒張時長（TD）、收縮速度（Ⅴs＝ As／Ts）、舒張速度（ⅤD＝ AD／TD）、收縮／舒張時長比（RS／D＝ Ts／TD）；（3）收縮活性指標［12］：收縮分數(shù)［F＝（收縮期起點管徑的平方－波谷管徑的平方）／收縮期起點管徑的平方］、收縮活力指數(shù)（Ⅰnd＝F×Freq）。

圖2 集合淋巴管自律運動中單次收縮／舒張循環(huán)基本參數(shù)定義示意圖

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，所有數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組自律運動基本特征比較

SHR組收縮頻率較Wistar組有所上升（14.20±6.00次／min vs 10.80±3.70次／min），但差異無統(tǒng)計學意義（t＝－1.61，P＞0.05），見圖3；兩組相對振幅差異亦無統(tǒng)計學意義（39.60%±16.50%vs 43.10%±14.90%，t＝0.54，P＞0.05），見圖4。

圖3 SHR組與Wistar組自律運動頻率

圖4 SHR組與Wistar組自律運動相對振幅

2.2 兩組自律運動力學特征比較

2.2.1 收縮振幅、舒張振幅：SHR組收縮振幅較Wistar組下降（38.40±15.00μm vs 48.60±19.30μm），舒張振幅也下降（37.70±14.90μm vs 47.60±19.10μm），但差異均無統(tǒng)計學意義（t值分別為1.42和1.38，P 均＞0.05），見圖5。

圖5 SHR組與Wistar組自律運動收縮振幅、舒張振幅

2.2.2 收縮時長、舒張時長：SHR組和 Wistar組大鼠收縮時長（1.43±0.30vs 1.54±0.23）和舒張時長（2.33±0.90vs 2.64±0.84）差異均無統(tǒng)計學意義（t值分別為0.95和0.84，P 均＞0.05），見圖6。

圖6 SHR組與Wistar組自律運動收縮時長、舒張時長

2.2.3 收縮速度、舒張速度：SHR組的收縮速度較Wistar組有所下降，但差異無統(tǒng)計學意義（28.10±12.00μm／s vs 32.60±13.50μm／s，t＝0.84，P＞0.05），舒張速度也有下降，差異亦無統(tǒng)計學意義（18.70±9.60μm／s vs 20.40±9.70μm／s，t＝0.67，P＞0.05），見圖7。

圖7 SHR組與Wistar組自律運動收縮速度、舒張速度

2.2.4 收縮／舒張時長比：SHR組收縮／舒張時長比與Wistar組差異無統(tǒng)計學意義（0.71±0.23vs 0.67±0.18，t＝－0.44，P＞0.05），見圖8。

圖8 SHR組與Wistar組自律運動收縮／舒張時長比

2.3 兩組自律運動收縮活性比較

SHR組收縮分數(shù)與Wistar差異無統(tǒng)計學意義（0.61±0.20vs 0.66±0.18，t＝0.58，P＞0.05），見圖9。SHR收縮活力指數(shù)雖較 Wistar組有所上升（8.62±4.27vs 6.93±2.64），但差異無統(tǒng)計學意義（t＝－1.13，P＞0.05），見圖10。

圖9 SHR組與Wistar組自律運動收縮分數(shù)

圖10 SHR組與Wistar組自律運動收縮活力指數(shù)

3 討 論

淋巴系統(tǒng)涉及脂類吸收與修飾、免疫、組織液回流、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等諸多方面［18］，其主要依托載體是淋巴液，處于淋巴管網(wǎng)絡體系外周的微淋巴管自律運動是主動泵取淋巴液并克服近心端阻力，推動淋巴液回流的主要動力來源［10］。微循環(huán)研究者于上世紀中后期已經(jīng)在微淋巴管的微觀結(jié)構(gòu)、功能和自律運動機制上取得了豐碩成果［19－21］。針對不同慢性病病理模型的微淋巴管自律運動變化及其潛在觸發(fā)機制研究成為當前研究的熱點［22，23］。Zawieja等［24］對代謝綜合征大鼠模型的腸系膜集合淋巴管自律運動模式的研究結(jié)果表明，使用高果糖飲食誘導7周后，SD大鼠腸系膜集合淋巴管發(fā)生了重塑，Ca2＋敏感性和淋巴管收縮功能下降，淋巴液輸出減少約50%。提示特定病理狀態(tài)下，集合淋巴管可能發(fā)生自律運動紊亂，并對體液循環(huán)有嚴重損害。但由于代謝綜合征模型是多種病理因素的“超級混合體”，不僅包括血壓升高，還包括血脂異常（甘油三酯升高和高密度脂蛋白膽固醇下降）、血糖升高和肥胖［25］，因而，無法了解其中單個因素（如血壓升高）與淋巴微循環(huán)功能紊亂之間的確切關(guān)系。為排除混雜因素的干擾，本研究選擇醫(yī)學界普遍認可的SHR進行集合淋巴管自律運動特征研究，單獨觀察血壓升高與微淋巴管自律運動模式的內(nèi)在聯(lián)系。

集合淋巴管在大鼠腸系膜上的存在方式多種多樣。大量脂肪組織和微血管不同程度與集合淋巴管的貼近或疊壓，可能對目標區(qū)段的管壁運動造成難以預料的物理限制。同時，一些比較彎曲的區(qū)段，以及緊鄰該區(qū)段上端、下端的匯合或分叉結(jié)構(gòu)，都可能產(chǎn)生不同程度的湍流。而且，微淋巴管管腔內(nèi)液體流態(tài)的任何微小變化都會直接引起剪切應力的改變，進而被微淋巴管敏銳地感知，并作出調(diào)節(jié)（即“Flow－mediated Autoregulation”）［26］。所 以，為 了盡可能保證各組待測目標管段所處基本物理條件的一致性，減少結(jié)果誤差，本研究所選取的淋巴管目標區(qū)段均較平直，上端無匯合，下端無分叉，具有瓣膜，脂肪組織堆塊和伴行的微血管均不直接緊貼管壁，無微血管跨壓，且處于連續(xù)自律運動中。測量位點均統(tǒng)一限定在瓣膜下游附近淋巴管直徑最大處。凡不滿足以上任一要求的淋巴管段均予排除，以降低誤導性結(jié)果出現(xiàn)的幾率。

檢測結(jié)果顯示，SHR組集合淋巴管自律運動各項特征指標與Wistar組相比變化較大者包括收縮頻率（增加31.50%）、收縮速度（降低13.80%）、收縮振幅（減小21.00%）、舒張振幅（減小20.80%）、收縮活力指數(shù)（上升24.40%），其余指標變化均在±10%以內(nèi)。上述指標的組間差異雖無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但SHR組的微小變化對分析微淋巴管自律運動還是有積極的提示作用。運動力學特征指標如收縮速度、收縮振幅、舒張振幅的下降可以反映SHR微淋巴管的收縮力已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的減弱；收縮頻率增加則可以理解為SHR經(jīng)此方式代償，由于收縮力減弱所導致的輸出能力的下降。收縮活性指標中微淋巴管收縮分數(shù)的定義本質(zhì)上類似于心臟的射血分數(shù)，用于近似估計每次收縮循環(huán)的淋巴液搏出量。本實驗中兩組收縮分數(shù)基本相同，但是單位時間內(nèi)總搏出量（即收縮活力指數(shù)）在SHR組有所升高，收縮頻率的代償性增加可能是其原因之一。因為淋巴液高效的逆壓力梯度搏出不僅依靠管壁的強烈收縮，同時還高度依賴瓣膜的協(xié)同開閉［18，27］，所以瓣膜開閉運動與管壁舒縮運動的協(xié)調(diào)性直接決定淋巴液凈輸出量。

3周齡SHR處在高血壓發(fā)展的初期階段，其淋巴微循環(huán)只表現(xiàn)出些許變化，尚未出現(xiàn)功能障礙，應在可調(diào)控范圍。體外研究表明，多種血管活性因子，如一氧化氮供體、前列腺素類、血栓素等，不僅對血管具有調(diào)節(jié)作用，亦能作用于微淋巴管上的同型受體，對淋巴管的自律收縮運動具有強烈的調(diào)節(jié)作用［6，28，29］。我們將進一步在體研究血管活性因子對微淋巴管自律運動的調(diào)節(jié)作用，并系統(tǒng)闡明高血壓持續(xù)發(fā)展過程中淋巴微循環(huán)自律運動模式的轉(zhuǎn)換，為探索淋巴微循環(huán)與高血壓發(fā)展機制提供更全面的實驗依據(jù)。