模擬大深度快速上浮脫險(xiǎn)兔血漿血管性血友病因子和一氧化氮水平變化

許 驥 何 佳 陳銳勇 顧靖華 劉曉波 陳 新 向 導(dǎo)

快速上浮脫險(xiǎn)是一種先進(jìn)的潛艇單人脫險(xiǎn)技術(shù)，基于不減壓潛水的原理，艇員經(jīng)過(guò)脫險(xiǎn)艙快速加壓至與艇外壓力平衡后，迅速上浮出水面等待援救［1］。理論上，脫險(xiǎn)深度越大，機(jī)體高壓暴露時(shí)間越長(zhǎng)，減壓上浮時(shí)循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)生成的小氣泡越多，越易造成血液循環(huán)障礙，發(fā)生減壓病的風(fēng)險(xiǎn)越高。減壓病是現(xiàn)今快速上浮脫險(xiǎn)研究邁向大深度所面臨的難題之一。目前，針對(duì)大深度快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的研究很少，也未見(jiàn)報(bào)道能客觀反映其損傷和用于臨床診治的敏感指標(biāo)。本研究采用新西蘭兔模擬大深度快速上浮脫險(xiǎn)過(guò)程，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物減壓病的發(fā)生情況，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前和出艙后動(dòng)物血漿中血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）濃度變化，分析大深度快速上浮脫險(xiǎn)對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)，探尋能反映快速上浮脫險(xiǎn)減壓損傷的檢測(cè)指標(biāo)，為深入研究減壓病的發(fā)生機(jī)制及臨床診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)成年雄性新西蘭兔16只，體重2.9±0.3kg，購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)［SCXK（滬）2014－0004］，在本所動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間動(dòng)物自由飲食。

1.2 主要器材和試劑

模擬快速上浮脫險(xiǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙（煙臺(tái)宏遠(yuǎn)公司），3K30型低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－Rad公司）等。

vWF檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法，批號(hào)CEA833Rb）購(gòu)自武漢優(yōu)爾生公司，NO檢測(cè)試劑盒（硝酸還原酶法，批號(hào)A012）購(gòu)自南京建成公司。

1.3 模擬大深度快速上浮脫險(xiǎn)方法

將實(shí)驗(yàn)兔編號(hào)標(biāo)記后置于模擬快速上浮脫險(xiǎn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)，緊閉艙門(mén)后由艙控電腦按預(yù)設(shè)自動(dòng)加減壓程序，在16s內(nèi)使用壓縮空氣以指數(shù)倍增方式（每4s艙壓增加一倍，即艙壓以2t／4指數(shù)速率增加）快速加壓至150m水深壓力（1.5MPa，表壓），穩(wěn)壓停留80s后，以30KPa／s的速率減壓至常壓后出艙。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

1.4.1 動(dòng)物行為及減壓?。簩?shí)驗(yàn)前及出艙后觀察動(dòng)物體毛、活動(dòng)度和反應(yīng)性，參照實(shí)驗(yàn)兔減壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］判斷動(dòng)物出艙后癥狀，并計(jì)算減壓病發(fā)生率。

1.4.2 血漿vWF和NO濃度檢測(cè)：動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后出艙時(shí)從耳緣靜脈各采血2ml置于肝素抗凝管中，4℃，5 000r／min，離心10min分離血漿，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法及硝酸還原法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前和出艙后血漿vWF、NO濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)前與出艙后數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物行為觀察及減壓病發(fā)生率

實(shí)驗(yàn)前新西蘭兔活躍自如，體毛順滑，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。實(shí)驗(yàn)后出艙時(shí)動(dòng)物均存活，其中5只體毛略顯凌亂，但反應(yīng)靈敏，行為正常，無(wú)明顯減壓病癥狀。另11只出現(xiàn)不同程度的減壓病癥狀，5只病情較輕：體毛凌亂、神態(tài)萎靡、行動(dòng)緩慢、對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍；6只病情較重：除上述癥狀外，還有后肢癱瘓、急促喘息等表現(xiàn)，10min內(nèi)死亡1只。10只存活減壓病兔癥狀均在出艙后1－3h內(nèi)陸續(xù)自行消失，行為逐漸恢復(fù)正常。

2.2 血漿vWF和NO濃度變化

出艙后實(shí)驗(yàn)兔血漿vWF、NO濃度較實(shí)驗(yàn)前均有顯著性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為－11.16和－4.93，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后兔血漿vWF和NO濃度（±s，n＝15）

表1 實(shí)驗(yàn)前后兔血漿vWF和NO濃度（±s，n＝15）

注：與實(shí)驗(yàn)前比較，1）P＜0.01

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3 討 論

以往研究認(rèn)為，在不安全減壓時(shí)，機(jī)體組織中溶解的惰性氣體會(huì)以小氣泡的形式析出，從而發(fā)生氣泡栓塞、機(jī)械性壓迫組織并引起機(jī)體一系列減壓病病理反應(yīng)［3］。與常規(guī)減壓病有所不同，由于快速上浮脫險(xiǎn)過(guò)程高壓暴露時(shí)間較短（一般不超過(guò)幾分鐘），體內(nèi)惰性氣體飽和－脫飽和過(guò)程基本都發(fā)生在以血液為代表的快組織（依據(jù)惰性氣體在機(jī)體各組織中溶解達(dá)到半飽和所需時(shí)間不同可將全身組織分為各類(lèi)理論組織，半飽和時(shí)間短的為快組織，時(shí)間長(zhǎng)的為慢組織）中，極少涉及慢組織［4］，故減壓氣泡絕大多數(shù)出現(xiàn)于血液中。循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的減壓氣泡對(duì)毛細(xì)血管和微靜脈影響最大，較大的氣泡會(huì)栓塞微血管，或引起微血管形態(tài)改變，血小板黏附，血栓形成，血流瘀滯，微循環(huán)障礙，進(jìn)而影響惰性氣體脫飽和，甚至產(chǎn)生大量致病因子，加重減壓病癥狀［5－7］。表明血液中減壓氣泡對(duì)血管內(nèi)皮的應(yīng)力刺激引發(fā)的某些血管內(nèi)皮因子改變是伴隨著減壓損傷出現(xiàn)的，并可能影響減壓病病程發(fā)展。因此針對(duì)某些血管內(nèi)皮因子的研究可以作為快速上浮脫險(xiǎn)減壓損傷研究的切入點(diǎn)。

vWF是一種由二硫鍵結(jié)合，在正常凝血過(guò)程中發(fā)揮重要功能的多聚糖蛋白，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，存在 Weibel－Palade小體內(nèi)。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷或受到某些物質(zhì)刺激時(shí)，vWF可以在短時(shí)間內(nèi)被釋放入血液中，橋連血小板黏附于血管內(nèi)皮下結(jié)構(gòu)，并與纖維連接蛋白一起與血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb－Ⅲa結(jié)合，誘導(dǎo)血小板聚集和血栓形成；同時(shí)，vWF能穩(wěn)定凝血因子Ⅷ促進(jìn)其活化，加速凝血［8，9］，成為反映血管內(nèi)皮損傷和血液高凝狀態(tài)的重要標(biāo)志物之一。在本研究中，動(dòng)物減壓出艙后血漿中vWF濃度較實(shí)驗(yàn)前顯著升高（P＜0.01），推測(cè)原因可能與減壓氣泡擠壓微血管內(nèi)壁造成內(nèi)皮損傷而引發(fā)vWF大量釋放有關(guān)，而且釋放量與動(dòng)物所受減壓損傷也可能相關(guān)。如果循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)出現(xiàn)高水平vWF則可能形成血栓，與氣體栓塞一起阻礙微循環(huán)，引發(fā)臟器缺血，導(dǎo)致減壓病，或加重病情。

NO是一種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信使分子，可在內(nèi)皮細(xì)胞中合成，具有廣泛的生物學(xué)作用。本研究結(jié)果顯示，動(dòng)物減壓出艙后血漿中NO濃度明顯高于實(shí)驗(yàn)前（P＜0.01）。高濃度NO可導(dǎo)致血管擴(kuò)張，同時(shí)妨礙血小板黏附和聚集［10］。結(jié)合快速減壓損傷實(shí)驗(yàn)后動(dòng)物血管內(nèi)血小板黏附、聚集、血栓化，微血管先出現(xiàn)反應(yīng)性收縮，然后擴(kuò)張松弛的現(xiàn)象［11］，推測(cè)實(shí)驗(yàn)后動(dòng)物血液中NO濃度增高很可能是機(jī)體出現(xiàn)減壓損傷后的一種應(yīng)激性保護(hù)機(jī)制。但微血管后期的擴(kuò)張松弛會(huì)導(dǎo)致血管壁通透性增加，滲出增多，血容量減少，血液流速降低，使得血液中過(guò)飽和氣泡不易經(jīng)肺部排出，而更容易通過(guò)擴(kuò)張后的毛細(xì)血管盲端進(jìn)入原本減壓氣泡很少的深層組織，從而加重減壓病病情。另外，過(guò)量的NO與氧自由基迅速反應(yīng)，生成具有巨大細(xì)胞毒性作用的亞硝酸自由基，會(huì)對(duì)機(jī)體造成更嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷［12］。

綜上所述，大深度快速上浮脫險(xiǎn)減壓可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿中vWF和NO水平升高，表明其內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷，可能是減壓病的發(fā)病機(jī)制之一。相比目前使用行為學(xué)觀察或監(jiān)聽(tīng)血流氣泡音判別減壓病的方法，血漿vWF和NO濃度測(cè)定可提供客觀量化的觀測(cè)指標(biāo)，但其更多作用和功效還需繼續(xù)觀察和論證，以期應(yīng)用于快速上浮脫險(xiǎn)減壓病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)判、早期診斷和預(yù)防治療。