抗病毒咀嚼片的質(zhì)量標準研究Δ

唐靖雯，潘梅（貴州威門藥業(yè)股份有限公司，貴陽 550018）

抗病毒咀嚼片由板藍根、石膏、地黃、廣藿香、連翹、蘆根、郁金、石菖蒲、知母9味中藥組成，具有清熱祛濕、涼血解毒的功效，主要用于風(fēng)熱感冒、瘟病發(fā)熱及上呼吸道感染、流感、腮腺炎等病毒感染性疾患?？共《揪捉榔瓰樗仄?，為增加該產(chǎn)品的穩(wěn)定性，避免片劑在儲存、運輸過程中發(fā)生因吸潮導(dǎo)致的花片、成分變化等影響產(chǎn)品質(zhì)量的情況發(fā)生，故對原素片進行了薄膜包衣。為確保制劑的安全性和有效性，本研究對其進行了質(zhì)量標準研究，采用薄層色譜（TLC）法鑒別制劑中連翹、知母、廣藿香3味中藥材，并用高效液相色譜（HPLC）法對制劑中連翹的主要有效成分連翹苷的含量進行定量分析。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、ChemStation色譜工作站、1200型自動進樣器（美國Agilent公司）；AG135型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CH-250型超聲波清洗機（天津恒奧科技公司，功率:250 W，頻率:40 kHz）；硅膠G（青島海洋化工廠分廠，批號:20100201）。

1.2 藥品與試劑

抗病毒咀嚼片（批號:120201、120202、120203，規(guī)格:0.75 g/片）、缺連翹的陰性樣品、缺知母的陰性樣品、缺廣藿香的陰性樣品均由貴州威門藥業(yè)股份有限公司自制。連翹苷對照品（批號:11081-201112，純度:96.8%）、菝葜皂苷元對照品（批號:110744-200509，純度:95.0%）、百秋李醇對照品（批號:110772-201206，純度:99.1%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，乙酸乙酯、三氯甲烷、冰醋酸、環(huán)己烷、無水乙醇、高氯酸、石油醚（60～90℃）均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 連翹的TLC鑒別 取抗病毒咀嚼片6片，研細，加甲醇30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20ml；合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。取缺連翹的陰性樣品和連翹對照藥材各適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺連翹的陰性樣品溶液和連翹對照藥材溶液。另取連翹苷對照品適量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。按TLC法[1]試驗，吸取上述供試品溶液、缺連翹的陰性樣品溶液、連翹對照藥材溶液及對照品溶液各4μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸（17∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾，詳見圖1。

圖1 連翹的TLC圖1～3.供試品（批號分別為120201、120202、120203）；4.缺連翹的陰性樣品；5.連翹對照藥材；6.連翹苷對照品Fig 1 TLC chromatogram of F.suspensa1-3.test samples（batch number:120201，120202 and 120203）；4.negative sample without F.suspensa；5.reference substance of F.suspensa；6.reference substance of phillyrin

2.1.2 知母的TLC鑒別 取抗病毒咀嚼片4片，研細，加甲醇30ml，超聲處理30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20ml使溶解，加鹽酸1.5ml，搖勻；再加甲苯10ml，加熱回流1 h，放冷；分取甲苯層，蒸干，殘渣加三氯甲烷1ml使溶解，作為供試品溶液。取缺知母的陰性樣品和知母對照藥材各適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺知母的陰性樣品溶液和知母對照藥材溶液。另取菝葜皂苷元對照品適量，加三氯甲烷制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按TLC法[1]試驗，吸取上述供試品溶液、缺知母的陰性樣品溶液、知母對照藥材溶液各6μl、對照品溶液2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶3，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以8%香草醛無水乙醇溶液與20%高氯酸溶液的混合溶液（1∶4，V/V），于85℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾，詳見圖2。

圖2 知母的TLC圖1～3.供試品（批號分別為120201、120202、120203）；4.缺知母的陰性樣品；5.知母對照藥材；6.菝葜皂苷元對照品Fig 2 TLC chromatogram ofA.asphodeloides1-3.test samples（batch number:120201，120202 and 120203）；4.negative samples without A.asphodeloides；5.reference substance of A.asphodeloides；6.reference substance of sarsasapogenin

2.1.3 廣藿香的TLC鑒別 取抗病毒咀嚼片8片，研細，加水60ml，連接揮發(fā)油測定器，測定管用超純水充滿刻度，再加入石油醚（60～90℃）1ml，回流提取2 h，放置至室溫，取石油醚層作為供試品溶液。取缺廣藿香的陰性樣品和廣藿香對照藥材各適量，按上述供試品溶液的制備方法制成缺廣藿香的陰性樣品溶液和廣藿香對照藥材溶液。另取百秋李醇對照品適量，加三氯甲烷制成每1ml含1mg的對照品溶液。按TLC法[1]試驗，吸取上述供試品溶液、缺廣藿香的陰性樣品溶液、廣藿香對照藥材溶液及對照品溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以8%香草醛無水乙醇溶液與20%高氯酸溶液的混合溶液（1∶4，V/V），于105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無干擾，詳見圖3。

圖3 廣藿香的TLC圖1～3.供試品（批號分別為120201、120202、120203）；4.缺廣藿香的陰性樣品；5.廣藿香對照藥材；6.百秋李醇對照品Fig 3 TLC chromatogram of P.cablin1-3.test samples（batch number:120201，120202 and 120203）；4.negative sample without P.cablin；5.reference substance of P.cablin；6.reference substance of patchouli alcohol

2.2 連翹苷的含量測定

2.2.1 色譜條件色譜柱:Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈-水（20∶80，V/V）；流速:1.0ml/min；檢測波長:230nm；柱溫:25 ℃；進樣量:10μl。

2.2.2 溶液的制備 （1）供試品溶液。取本品10片，除去包衣膜，研細，取約1.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過；精密量取續(xù)濾液25ml，蒸干，用水30ml分次溶解，加于已處理好的D101大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長20 cm）上，以每分鐘約3～4ml的流速，用水80ml洗脫；棄洗脫液，再用30%甲醇100ml洗脫，棄洗脫液；用甲醇100ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解，移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45 μm）濾過，即得。（2）對照品溶液。取連翹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成每1ml約含0.01mg的溶液，即得。（3）缺連翹的陰性樣品。按處方量稱取缺連翹的群藥，按上述供試品溶液的制備方法制成缺連翹的陰性樣品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗[2-4]取“2.2.2”項下對照品、供試品、缺連翹的陰性樣品溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。理論板數(shù)按連翹苷峰計算＞3000，分離度＞1.5。色譜詳見圖4。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取連翹苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成 5.35、26.75、53.50、80.25、107.00、133.75、267.50μg/ml的系列質(zhì)量濃度溶液，按“2.2.1”項下色譜條件，各進樣10μl，測定峰面積。以連翹苷進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行回歸分析，得回歸方程為y＝1938.9x－6.7743（r＝0.9999）。結(jié)果表明，連翹苷進樣量在0.0535～2.675μg范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖4 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.缺連翹的陰性樣品；1.連翹苷Fig 4 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative samples without F.suspensa；1.forsythin

2.2.5 精密度試驗 取連翹苷對照品適量，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10μl，按“2.2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，峰面積的RSD為1.68%，表明儀器精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品（批號:120201）溶液適量，于放置0、3、6、7.5、9、11 h時，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰。結(jié)果，峰面積的RSD為1.74%，表明供試品溶液在11 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（批號:120201）6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以外標一點法計算連翹苷的含量。結(jié)果，含量的RSD為0.87%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號:120201，連翹苷含量為0.4853mg/g）6片，研細，平行稱取6份，每份約1.0 g，分別精密稱定，再分別精密加入連翹苷對照品溶液（49.0μg/ml）10ml，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，計算連翹苷的加樣回收率，結(jié)果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.9 樣品含量測定 取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制成供試品溶液，精密吸取10μl注入HPLC儀，按“2.2.1”項下色譜條件記錄色譜圖；另取“2.2.2”項下對照品溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算供試品的含量，結(jié)果詳見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

本研究對方中連翹進行TLC定性鑒別時[4]，曾分別采用石油醚超聲提取后經(jīng)甲醇提取、甲醇索氏提取后經(jīng)三氯甲烷萃取、甲醇超聲提取后經(jīng)乙酸乙酯萃取等方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)甲醇超聲提取后再以乙酸乙酯萃取對應(yīng)的色譜斑點清晰、分離效果較好、靈敏度較高，故選擇該樣品處理方法。廣藿香TLC定性鑒別時，顯色劑的選擇曾采用5%三氯化鐵乙醇溶液、5%香草醛無水乙醇溶液，最終以8%香草醛無水乙醇溶液與20%高氯酸溶液的混合溶液（1∶4，V/V）為展開劑所得的樣品斑點較為清晰。

在選擇本品的含量測定指標時，因方中連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的作用，與制劑的功能主治一致，因此選用連翹中的主要指標成分連翹苷作為本品的質(zhì)量控制指標。據(jù)文獻報道，連翹苷含量的測定方法主要有TLC法[5]、HPLC法[6-8]、紫外分光光度法[9]等。本試驗采用HPLC法進行含量測定。在前處理方法選擇時，曾考察了甲醇、50%甲醇和乙腈-水（20∶80，V/V）對提取效果的影響，結(jié)果以甲醇為提取溶劑提取的連翹苷含量最高；超聲處理和加熱回流提取效果相當，為了操作簡單，故選超聲提取方法。據(jù)文獻報道，測定連翹苷含量多采用的流動相為乙腈-水（25∶75，V/V）[10-11]，但該流動相用于本品，其樣品雜質(zhì)峰干擾太大；經(jīng)流動相比例調(diào)整為乙腈-水（20∶80，V/V）后，可使連翹苷峰與雜質(zhì)峰分開，且能保證基線平穩(wěn)、峰形對稱、分離度好。

綜上所述，本方法操作簡便、快速，結(jié)果準確、可靠，重復(fù)性好，可用于抗病毒咀嚼片的質(zhì)量控制。

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