不同產(chǎn)地丁公藤藥材的HPLC特征圖譜對比研究Δ

文婧，孫洪章，盧靜華（遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

中藥丁公藤[1]為旋花科植物丁公藤Erycibe obtusifolia Benth.或光葉丁公藤[2]Erycibe schmidtii Craib的干燥藤莖[3]，為廣東、廣西民間用于抗風(fēng)濕的傳統(tǒng)藥，是廣西壯族民間傳統(tǒng)用藥，有祛風(fēng)除濕、消腫止痛[4]的作用，可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、半身不遂和跌打腫痛。目前所檢測到關(guān)于丁公藤藥材的文獻(xiàn)大多是對其進(jìn)行含量測定，暫時沒有利用指紋圖譜[5]技術(shù)進(jìn)行質(zhì)量控制的研究。為控制和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性，依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的《中藥注射劑色譜指紋圖譜實驗研究技術(shù)指南（試行）》，本課題組對12批不同地區(qū)的丁公藤藥材進(jìn)行了特征圖譜分析和相似度的計算，該方法能夠從整體上控制丁公藤藥材的質(zhì)量，達(dá)到鑒別真?zhèn)蝃6-7]、評定藥材優(yōu)劣的目的，可為藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

L-2000型高效液相色譜（HPLC）儀，包括G1311A型四元梯度泵、WLJYQ型進(jìn)樣器、G1315A型二極管陣列檢測器（日本日立公司）；KQ-100A型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；GM-0.33A型無油真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；1810-B型石英自動雙重純水蒸餾器（江蘇宏華儀器廠）；BSA224S型電子天平（德國賽多利斯集團）。

1.2 試劑

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110753-200413，純度≥99%）；東莨菪苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號:20120910，純度≥99%）；東莨菪內(nèi)酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110768-200504，純度≥99%）；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

所有藥材樣品均經(jīng)過遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥科承偉教授鑒定，為旋花科植物丁公藤E.obtusfolia Benth或光葉丁公藤E.schmidtii Craib的干燥藤莖。樣品來源詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Hypersil ODS C18（200mm×4.6mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脫，梯度洗脫程序詳見表2；流速:1.0ml/min；檢測波長:347nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以綠原酸峰計，不低于3000，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

表1 樣品來源Tab 1 Samples’origins

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution programs

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取東莨菪苷[8]、東莨菪內(nèi)酯[9-10]、綠原酸[11]對照品3.60、3.99 、4.12mg，分別配制成每1ml含0.360、0.399、0.412mg的對照品溶液。再分別精密量取上述3種溶液各2.5ml，置于25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸質(zhì)量濃度分別為0.0360、0.0399、0.0412mg/ml的混合對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液 稱取丁公藤藥材細(xì)粉（過四號篩）約2.5 g，置于具塞錐形瓶中，放置過夜，稱定質(zhì)量，超聲（功率:100 W，頻率:40 kHz）提取30min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，以半徑為3 cm、3500 r/min離心10min，定容于25ml量瓶中，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 參照峰的選擇

精密量取“2.2”項下供試品溶液（批號:110501）和混合對照品溶液各20μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，詳見圖1。丁公藤藥材經(jīng)HPLC分析出現(xiàn)多個色譜峰，以綠原酸色譜峰（S）作為參照峰。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液20μl，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄各共有色譜峰的保留時間和峰面積。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸的峰面積的RSD分別為1.33%、0.96%、1.85%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批次丁公藤藥材（批號:110501）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件，分別于配制0、2、4、8、16、24h時進(jìn)行測定。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸的峰面積的RSD分別為2.12%、1.35%、1.41%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品（批號:110501）；3.東莨菪苷；4.綠原酸；6.東莨菪內(nèi)酯Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample（lot No.110501）；3.scopolamine glycosides；4.chlorogenic acid；6.scopoletin

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批次丁公藤藥材（批號:110501）適量，按“2.2.2”方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，東莨菪苷、東莨菪內(nèi)酯和綠原酸峰面積的RSD分別為0.21%、1.35%、1.87%，表明本方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.4.4 特征圖譜的建立及評價 取12批不同產(chǎn)地的丁公藤藥材各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。根據(jù)12批樣品特征圖譜的特點，可以確定10個峰作為共有特征峰，并標(biāo)定了其中的3個色譜峰，其中3號峰為東莨菪苷峰，4號峰為綠原酸峰，6號峰為東莨菪內(nèi)酯峰，這3個峰分離度較好，保留時間適宜，因此可以作為參照峰（東莨菪苷峰、綠原酸峰、東莨菪內(nèi)酯峰是丁公藤藥材的有效成分，后來含量測定測的就是東莨菪苷、綠原酸和東莨菪內(nèi)酯的含量?！?.3”項中“以綠原酸色譜峰（S）作為參照峰”，這是選擇峰面積最大的綠原酸峰作為參考來標(biāo)定10個峰的），色譜見圖1（B）。將各批丁公藤藥材的特征圖譜信號導(dǎo)入國家藥典委員會主持開發(fā)的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》，計算生成對照特征圖譜，12批藥材特征圖譜的共有模式詳見圖2，共有峰的相對保留時間和相對峰面積值詳見表3，并計算對照圖譜和12批樣品圖譜之間的相似度數(shù)據(jù)，相似度計算結(jié)果詳見表4。相似度在0.90以上認(rèn)為符合要求，為推薦品；0.90以下的為非推薦品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第7批和第11批樣品相似度小于0.90，不推薦使用。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

試驗中考察了100%、50%甲醇超聲提取法和100%、50%乙醇超聲提取法[12]及100%乙醇的加熱回流提取方法。結(jié)果表明，100%甲醇超聲提取法中大部分峰能在色譜圖中真實體現(xiàn)，故選此法。

3.2 檢測波長的選擇

圖2 12批丁公藤藥材的特征圖譜Fig 2 Fingerprint of 12 batches of E.obtusifolia

對丁公藤的甲醇超聲提取液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果最大吸收波長在299、347nm處。分別以254、299、326、347nm為檢測波長，記錄色譜圖，結(jié)果在347nm波長下的色譜圖中出峰數(shù)目較多，且各峰信號大小比較均勻，分離度較好。綜合考慮，選擇347nm作為丁公藤藥材特征圖譜的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

試驗分別以甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，記錄色圖譜。結(jié)果顯示，以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，特征峰出現(xiàn)時間較晚，且峰形稍有拖尾；為使避免峰型拖尾，在有機相乙腈中加入0.1%的磷酸，可以看出譜圖特征峰出現(xiàn)時間適宜，且峰形明顯較好、分離度好、基線漂移小，因此以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，在347nm處進(jìn)行檢測，能獲得很好的分離效果。

表3 12批樣品特征圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積值Tab 3 Relative retention time and relative peak area of common peaks of characteristic spectrum of 12 batches of samples

表4 12批藥材HPLC特征圖譜相似度分析結(jié)果Tab 4 Result of similarity analysis of fingerprints of 12 batches of samples

本試驗對不同產(chǎn)地的12批丁公藤藥材進(jìn)行了特征圖譜研究[13]，用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版）》進(jìn)行分析，得到了丁公藤藥材的對照用特征圖譜，以及12批藥材相對于對照特征圖譜的相似度。結(jié)果表明，本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為有效地控制丁公藤藥材的內(nèi)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

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